实验一MS培养基配制和灭菌

1、实验一MS 培养基配制和灭菌一目的和要求 ：1. 学会 MS培养基的制作方法 ;2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。二、仪器与试剂1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（ 500ml）、培养皿、移液管等2. 试剂：MS的 Macro-e、Micro-e 、有机母液、 Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉， 1N NaoH和 1N HCl三、方法步骤（一）配方设计 :以 MS为基本培养基（ mg/L）No.6-BANAAIBACK0010.50.121.00.132.00.241.00.252.00.2（二）配制培养基(1) 溶化琼脂：量取 300ml左右蒸馏水，加入 4.8g 琼脂粉，加热溶解直至完全

2、融化。(2)各种母液的吸取： Macro-e50mlMicro-e1ml有机成分1mlFe盐5ml肌醇10ml加在一起，倒入烧杯（ 1L)（3）加入糖 : 称取 30g蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。（4）根据实验设计，量取生长调节剂: 加在一起，倒入烧杯。（5）定容 : 加蒸馏水（用量杯）。（6）调节 pH至5.8 ，用 pH试纸进行测定，用 1molHcl 或 1Mol NaoH调节。（7）分装 :30 40 ml/ 瓶6，培养基勿碰三角瓶口。（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。（三）灭菌：用高压蒸汽消毒

3、器灭菌，其压力为0.12 0.15MPa,温度为 120126，保持 1520 min。具体操作步骤：1. 加水；2. 把包扎好的培养基装入高压锅；3. 盖上热压锅盖 , 上紧螺帽 ( 注意对角拧紧螺帽 ) 关上气阀和安全阀；4. 加热；5. 排除冷空气；6. 排除冷空气后 , 关闭放气阀，待压力升到 1Kg 位置时，开始计算灭菌时间，一般在 1Kg 压力 (121 ) 下灭菌 1520 分钟即可，但要注意保持稳定压力。7. 灭菌时间达到 20 分钟后，停止加热，待压力自动降到 0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖 ( 注意对角扭松螺帽 ) 稍待冷后再把培养基取出。四 . 作业1. 总结配制培

4、养基的注意事项。2. 制作培养基前为何要提前配制母液 ?实验二短柄五加无性系建立一目的和要求 ：1. 学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作 ;2. 掌握无菌操作技术。二、材料、仪器与试剂1. 材料：短柄五加休眠枝短柄五加 ( Eleutherococcus brachypus Harms. ) 为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。其茎具有较高的药用价值， 有治疗神经衰弱、 妇女更年期综合症、 继发性高血压、白细胞减少等功效。2. 仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（ 500ml）、培养皿等3. 试剂：配制好的 MS培养基各种

5、母液、 1mol/L 的NaOH、1mol/LHCL、 0.1%的升汞、 70%的乙醇。三、方法步骤( 一)无菌操作准备阶段接种室： 1、紫外灯提前照20-30min 。2 、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。操作人员： 1、穿专用实验服，戴口罩。2 、剪短指甲，流水洗手三次。操作阶段1、清理工作台面， 70%乙醇擦三次。2、70%乙醇擦手三次。3 、避免说话和来回走动( 二) 无性系建立1. 配制启动培养基CK MS MS+6-BA 0. 5 mg/L + NAA0.1mg/L MS+6-BA 1.0 mg/L + NAA0.1mg/L MS+6-BA 2. 0 mg/L + NAA0.2mg/L

6、 MS+6-BA 1. 0 mg/L + IBA0.2mg/L MS+6-BA 2. 0 mg/L + IBA0.2mg/L2. 材料的选择 ：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。3. 培养步骤 ：（1）外植体消毒：去杂流水水洗1 2h70%乙醇（ 8-10s ）无菌水洗3-5 次 0.1%HgCl2（ 10min）无菌水水洗 5 次（2）接种：用剪刀将灭菌后的枝条剪成长约 11.5 cm 的单芽茎段。将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。（3）培养：培养物置于25 左右的培养室中，每天光照12小时，光照度为 850-1200lx 。（4）观察：定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。四、 作业1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的最佳培养基配方。植物生长调节剂No.接种数 / 个萌芽数 / 个污染数 / 个萌芽率 /%芽生长情况6-BANAA IBAC