原核基因表达调控1.ppt

1、7.3 色氨酸操纵子与负控阻遏系统,色氨酸操纵子的转录调控包括： （1）阻遏系统 （2）弱化系统,色氨酸操纵子的结构 调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,trpR,trp,特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开,7.3.1 色氨酸操纵子的阻遏系统,1.色氨酸操纵子(tryptophane operon) 负责色氨酸的生物合成。当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达，色

2、氨酸或与其代谢有关的某种物质在阻遏过程中起作用。 这个系统的效应物是色氨酸，是try操纵子所编码的生物合成途径的末端终产物。,2. 色氨酸的合成,色氨酸的合成分5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因紧密连锁在一起，被转录在一条多顺反子mRNA上，分别以 trpE-邻氨基苯甲酸合成酶 trpD-邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶 trpC-邻氨基苯甲酸异构酶 trpB-色氨酸合成酶 trpA-吲哚甘油-3-磷酶合成酶,细菌中的色氨酸生物合成途径,3.色氨酸操纵子(trp)结构,包括: 调节基因（R） 启动子 （P） 操纵基因（O） 引导序列（L）及弱化子a 结构基因（E、D、C、B、A）,大肠杆

3、菌中的色氨酸操纵子,大肠杆菌中的色氨酸操纵子组成和功能,trp 操纵子O的结构,trp 操纵子的阻遏系统,低Trp时： 阻遏物不结合操纵基因; 高Trp时： 阻遏物+Trp 结合操纵基因,7.3.2 弱化子与前导肽,1.弱化子 ：在负控阻遏系统调节的基因中，起终止转录信号作用的一段核苷酸片段，称为弱化子。 DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-150区）。 弱化子调控是转录调控中的微调控（或细调控）。在这个系统中，酶的浓度根据氨基酸浓度的变化而受调节。,弱化子,123150,2. 前导肽与前导序列,前导肽是前导序列产生的一个含14个氨基酸的多肽。 前导肽对应的mRNA序列为前导序

4、列。 前导序列在trp mRNA5/端trpE基因的起始密码前有一段长162bp的片段，称为前导区。,前导序列和前导肽结构,3. mRNA前导区分析,前导序列结构特点 易形成茎环结构，有8个U的终止信号序列 1和2区形成第二个发夹结构 3和2也形成发夹结构 有前导肽 有二个相邻色氨酸密码子（UGGUGG),前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,前导序列的二级结构与衰减子构象,第1种构象：较稳定构象，在离体条件下存在。 特征：1区和2区配对； 3区和4区配对，为衰减子构象。 此种构象的衰减子使后面转录提前结束。 第2种构象：在细胞内和离体均存在

5、。 特征：2区和3区配对； 此种构象可RNA聚合酶继续转录。,前导序列二级结构,前导序列 二级结构与衰减子构象,4.转录的弱化作用-衰化机制,（1）trp饥饿-抗衰减作用，即转录继续进行。 当无色氨酸存在时，核糖体在1区内的trp密码子位置停顿相当长时间，1区处于核糖体覆盖之下，不能同2区作碱基配对。但2区和3区就可以有碱基配对，迫使4区处于单链形式，不能形成二级结构的终止信号，结果RNA聚合酶就穿过衰减子区继续转录进程。,trp饥饿-抗衰减作用,（2）非trp饥饿-转录终止 当有色氨酸存在时，核糖体能合成前导肽。核糖体伸展到2区，阻碍1区与2区的碱基配对，但3区和4区可以进行碱基配对，产生终

6、止信号，结果RNA聚合酶就在衰减子区停止转录。,非trp饥饿-转录终止,弱化子的弱化作用机制,前导肽,转录终止结构,小结： trp操纵子弱化机制,7.3.3 trp操纵子弱化机制的实验证据,研究方法： 前导区的调节作用证据,细菌中为什么要有弱化子系统呢？一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。或者，弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起trp操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加trp基因表达，从而提高内源色氨

7、酸浓度。 那么为什么还要有阻遏体系呢？ 目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导mRNA的合成，它使这个合成系统更加经济!,总结！ trp操纵子调控,trp操纵子调控方式： 1、粗调控-阻遏作用 即启动子-操纵基因系统受阻遏蛋白的负调控 。信号是细胞内的色氨酸的多少。 2、细调控-弱化作用 核糖体对mRNA前导序列L中弱化子的结合对转录终止进行调控。信号是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。,其它氨基酸饥饿对trp弱化子的作用,1、甘氨酸饥饿时，核糖体停留在前导序列的甘氨酸密码子GGU上， trp操纵子不能表达。 2、苏氨酸饥饿时，核糖体停留在前导序列的甘氨酸密码子AUC

8、上， trp操纵子不表达。 3、精氨酸缺乏时，与trp饥饿相同，RNA聚合酶可以继续转录。,衰减作用的普遍性,存在衰减作用的调控十分普遍。 大肠杆菌的trp、val、phe、thr、leu； 沙门氏菌的his、leu、嘧啶合成等；,7.3.4 trp操纵子的其他调控机制,大肠杆菌trp操纵子与枯草埃希菌trp操纵子比较,7.4 其他操纵子,7.4.1半乳糖操纵子(galactose operon),异构酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)半乳糖激酶(galk)。,7.4 其他操纵子的调控机制,7.4.1 半乳糖操纵子 大肠杆菌半乳糖操纵子(galactose operon)包

9、括3个结构基因： 异构酶(UDP-galactose-4epimerase,galE)，半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase, galT)， 半乳糖激酶(galactose kinase, galk)。 这3个酶的作用是使半乳糖变成葡萄糖-1-磷酸。GalR与galE、T、K及操纵区O等离得很远，而galR产物对galO的作用与lacI-lacO的作用相同。,gal操纵子,gal操纵子lac操纵子ara操纵子比较,gal操纵子的特点： 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 它有两个O区，一个在P区上游-67-53，另一个在结构基因galE

10、内部。,7.4.2 阿拉伯糖操纵子 阿拉伯糖(arabinose)是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖。 在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要3个基因：araB、araA和araD，分别编码3个酶： araB基因编码核酮糖激酶(ribulokinase)， araA编码L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase)， araD编码L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶(L-ribulose-5phosphate-4epimerase)。 与araBAD相邻的是一个复合的启动子区域和一个调节基因araC，这个AraC蛋白同时显示正、负调节因子的功能。AraBAD和araC基因的转录是分别

11、在两条链上以相反的方向进行的。在标准的遗传学图谱上，araBAD基因簇从启动子PBAD开始向左进行转录，而araC基因则是从Pc向右转录。,ara操纵子的调控有两个特点： 第一，araC表达受到AraC的自身调控。 第二，AraC既是ara操纵子的正调节蛋白（需cAMP-CRP的共同参与，起始转录），又是其负调节蛋白。这种双重功能是通过AraC蛋白的两种异构体来实现的（Pi和Pr)。,1. AraC蛋白的正负调节作用,AraC蛋白作为PBAD活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的。 Pr是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合， 而Pj是起诱导作用的形式

12、，它通过与PBAD启动子结合进行调节。 在没有阿拉伯糖时，Pr形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与AraC蛋白结合，使平衡趋向于Pi形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与Pr的结合，使Pr离开它的结合位点，然后，产生大量的Pi，并与启动子结合。,2. AraC蛋白的两种形式,3. 营养状况对ara操作子的影响,7.4.3 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答,SOS反应的机理： 由 RecA 蛋白和 LexA 阻遏物的相互作用引起的。 LexA阻遏物：是SOS DNA修复系统所有基因的阻遏物 RecA蛋白：是SOS反应的最初的发动因子。在单链DNA和ATP存在时，Re

13、cA蛋白被激活，表现出水解酶活性，分解LexA阻遏物。 当RecA水解LexA阻遏物后，导致SOS体系（包括recA基因）高效表达，DNA得到修复,7.4.4 二组分调控系统与信号传导,二组分调控系统： 由两种不同蛋白质组成。 （1）膜上传感蛋白； （2）细胞质中的应答调节蛋白；,7.4.5 多启动子调控的操纵子,I rRNA操纵子大肠杆菌rRNA操纵子（rrnE）上有两个启动子，P1和P2。P1是强启动子，营养充沛时，由P1起始的转录产物比由P2起始的转录产物高3-5倍。当营养匮乏时，P1的作用被抑制，但P2仍有功能。,II. 核糖体蛋白SI操纵子核糖体蛋白SI操纵子（rpsA），它也受应急

14、反应调节。RpsA有4个启动子，P1、P2是强启动子，平时主要依靠它们来启动基因的表达，合成SI蛋白。P3、P4是弱启动子，只有在紧急情况下，P1、P2启动子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的SI蛋白维持了生命的最低需要。,III. Dna Q蛋白操纵子 Dna Q蛋白是DNA聚合酶全酶的亚基之一，其主要功能是校正DNA复制中可能出现的错误。在RNA聚合酶活性较低时，操纵子的转录由弱启动子P2控制；而RNA聚合酶活性较高时，就开始利用强启动子P1。,7.5 固氮基因调控（自学）,7.6 转录水平上的其他调控方式,转录过程的调控是生物基因表达调节最有效的方式，体现在任一过程。 转录起始阶

15、段的调控包括： 不同因子的选择性使用，操纵子调控。,7.6.1 因子的调节作用,因子的调节作用：独立作用和交互作用 因子活性调控： 1、被蛋白水解酶的调控 2、能被同源的抗因子失活，阻止与RNA聚合酶核心酶组装 举例：革兰氏阳性菌形成孢子-4种因子 P270图,7.6.2 组蛋白类似蛋白的调控作用,细菌体内的非特异性DNA结合蛋白是：组蛋白类似蛋白 举例：细菌的H-NS蛋白-结构特点： 2个结构域：DNA结合结构域，蛋白-蛋白相互作用结构域。 作用： 1、维持DNA的高级结构，形成多聚体； 2、可与大肠杆菌基因组上大量分散基因调控区结合，抑制基因转录。,7.6.3 转录调控因子的作用,转录调控

16、因子是指能够与基因的启动子区相结合，对基因的转录起激活或抑制作用的DNA结合蛋白。 大多数是序列特异性结合蛋白。 作用：有的能调控大量基因的表达，有的仅调控1-2个基因的表达。 举例：转录调控因子CRP、ArcA调控50%的表达；也有60个转录因子调控2个启动子；,7.6.4 抗终止因子的调控作用,抗终止因子是能够在特定位点阻止转录终止的一类蛋白质。 当这些存在时，RNA聚合酶能够越过终止子，继续转录DNA。 这种调控主要在噬菌体和少数细菌中，当RNA聚合酶到终止子之前与RNA聚合酶结合，只有与抗终止因子结合的RNA聚合酶才能顺利通过具有茎环结构的终止子，使转录继续进行。 P271图 举例：大

17、肠杆菌的抗终止子的蛋白：Nus蛋白 转录的起始和终止过程中， RNA聚合酶分别受到因子和NusA蛋白的调控。,7.7.1 mRNA自身结构元件对翻译起始的调节 7.7.2 mRNA稳定性对转录水平的影响 7.7.3 调节蛋白的调节作用 7.7.4 反义RNA的调节作用,7.7 转录后调控,7.7.1 mRNA自身结构元件对翻译Q起始的调节,1、翻译起始于核糖体的30S亚基对mRNA上起始密码的识别。AUG的识别有fMet-t RNA中的UAC完成配对。 原核生物的起始密码子使用 AUG 常用 GUG 14%，与fMet-t RNA中的UAC配对弱 UUG 3%，与fMet-t RNA中的UAC

18、配对弱 AUU,2、 mRNA上的核糖体结合位点（RBS)与SD序列结合强度及起始密码AUG的距离。 SD与AUG之间距离4-10个核苷酸，9个最佳。 3、 mRNA的二级结构对翻译起始的调控。 SD序列的微小变化影响mRNA的二级结构。,7.7.2. mRNA稳定性对转录水平的影响,细菌的mRNA半衰期2-3分钟。 mRNA的降解取决于二级结构。 举例：大肠杆菌的CsrAB系统 CsrA是RNA结合蛋白， CsrB是非编码的RNA分子。,7.7.3 调节蛋白的调节作用,mRNA上的结合蛋白和特异性抑制蛋白，可通过与核糖体的竞争性结合来抑制翻译起始。 举例：大肠杆菌中核糖体蛋白 P274图,7

19、.7.4 反义RNA的调节作用,RNA调节是原核生物基因表达转录后调节的重要机制。 细菌受环境影响会产生一宿非编码的小RNA。 小RNA作用：能与mRNA上特定序列结合配对并改变mRNA的构象，导致翻译被开启货关闭，也可能导致目标mRNA快速降解。 举例：细菌铁蛋白,7.7.5稀有密码子对翻译的影响,大肠杆菌DNA聚合酶的RNA引物,dnaG(引物酶) RNA引物,dnaG、rpoD和rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子,细胞需要数量： 50个拷贝的dnaG蛋白、2800个拷贝的rpoD和40000个拷贝的rpsU,几种蛋白质中异亮氨酸密码子使用频率比较,结论： 细胞内对应于稀有密码子的

20、tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。,7.7.6 重叠基因对翻译的影响 重叠基因最早在大肠杆菌噬菌体X174中发现，用不同的阅读方式得到不同的蛋白质，丝状RNA噬菌体、线粒体DNA和细菌染色体上都有重叠基因存在。 Trp操纵子由5个基因（trpE、D、C、B、A）组成，在正常情况下，操纵子中5个基因产物是等量的，但trpE突变后，其邻近的trpD产量比下游的trpBA产量要低得多。这种与蛋白无关的表达调控，已被证实是在翻译水平上的调控。,大肠杆菌噬菌体X174重叠基因对翻译的影响,TrpB 谷氨酸- 异亮氨酸-终止 GAA - AUC - UGA - UGG - AA AUG - GAA 甲硫氨酸 谷氨酸trpA,trpE苏