[硕士论文精品]大鼠肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预研究

肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及十预大鼠肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预研究中文摘要肾缺血再灌注损伤是肾脏移植巾不可避免的病理生理过程。同时在临床上，如急性缺血性肾功衰竭、心肺复苏、心脏体外循环、失血性休克、需暂时阻断肾血流的手术等，均可导致肾缺血再灌注损伤。既往的研究对肾缺血再灌注损伤急性期研究较多，近年来研究显示。肾脏缺血再灌注损伤不仅可导致近期肾脏损伤而日对远期肾脏功能也有影响。我们拟观察大鼠肾缺血再灌注损伤的远期改变及进行约物于预研究。本文分两部分第一部分通过研究黄芪甲甙对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响，观察黄芪甲甙是否对大鼠肾缺血再灌注损伤具有保护作用并筛选出最佳用药剂量供第二部分参考使用；第二部分观察大鼠肾缺血再灌注损伤的远期改变及药物干预研究。第一部分黄芪甲甙对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用目的研究黄芪甲甙对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响。方法采用SD雄性大鼠体重240260G，右侧肾切除，左侧肾动脉夹闭60分钟肾缺血后再灌注24小时模型。随机分成肾缺血再灌注组MODEL、假手术组SHAM、黄芪甲甙低剂量组LOW、黄芪甲甙中剂量组MEDIUM和黄芪甲甙高剂量组HIGH等5组，每组6只。各组分别处理如下LOW组、MEDIUM组和HI曲组按手术前2小时作为时间点，术前3天分别给予1、5和10GL黄芪甲甙溶液2ML灌胃，MODEL组、SHAM组以等量的生理盐水代替，观察不同剂量黄芪甲甙对肾脏缺血再灌注损伤大鼠血清肌菅C0、肾组织的病理变化，肾组织超氧化物歧化酶SOD活性和肿瘤坏死因子TNF的变化。结果HI曲组光镜下可见到肾小管上皮细胞变性，肾皮、髓质交界部肾小管内蛋白管型，问质炎性细胞浸润均较MODEL组减轻；MEDIUM组、LOW组与MODEL组相比无明显改善。SHAM组基本正常。HI窟11组血清CR2493249PMOLL、肾组织SOD98251035烈UGTISSUE、TNF值334029NGGTISSUE与MODEL组血清CR3493335GMOLL、肾组织SOD7308730NUGTISSUE、TNF一728021NGGTISSUE相比差别有统计学意义PO05。结论一定剂量黄芪甲甙能明显抑制缺血再灌注所致的肾组织SOD活性的降低和TNF一的产生，对大鼠肾缺血再灌注损伤具有保护作用。关键词黄芪甲甙；缺血再灌注损伤SOD；TNFA肾脏缺血雨灌沣损伤的远期改变及F预第二部分大鼠肾缺血再灌注损伤的远期改变及黄芪甲甙对其影响目的观察大鼠肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及黄芪甲甙对其影响。方法采用SD雄性大鼠体重200220G，右侧肾切除，左侧肾动脉夹闭60分钟肾缺血再灌注模型。54只实验动物随机分成肾脏缺血再灌注损伤组IRI，药物组ASTRAGALOSIDEIV,ASTR和假手术组SHAM，每组又分为3个时间点，每时间点6只，共9个小组。ASTR组手术前后3天给予10GL黄芪甲甙溶液2ML灌胃，模型组、假手术组以等量的生理盐水代替。观察肾缺血再灌注损伤大鼠术后4W、12W和24W血清肌酐CO、尿蛋白，L肾组织的病理，胶原染色及免疫组化检测转化生长因子BLTGFB1、单核细胞趋化蛋白一1MCP一】、III型胶原及EDL细胞的蛋白表达，RTPCR检测TGFB1、MCP一1、II】型胶原MRNA表达变化。结果肾组织病理切片观察可见IRI组部分外髓部偶见蛋白管型，少量间质炎性细胞浸润，血清CR、体重和肾重随时间延长进行性增加，但同一时间点任何两组之间无明显差别。IRI组尿总蛋白随时间延长进行性增加，术后24WTGFB1、MCPL、III型胶原蛋白、MRNA表达和间质中ED1阳性细胞数增加与SHAM组相比差别有统计学意义PO05。结论1术后24周，IRI组虽然常规病理切片无明显改变但与肾纤维化相关的TGFB1、MCP1和IIL型胶原蛋白、MRNA的表达均明显升高，同时肾组织中巨噬细胞浸润增加，已有肾纤维化早期改变。2肾脏缺血再灌注损伤不仅可导致近期肾脏损伤而且对远期肾脏功能也有影响。3术后24周，10GL黄芪甲甙能够下调TGFP1、MCP一1和III型胶原蛋白和MRNA的表达，同时减轻肾组织中巨噬细胞浸润，提示黄芪甲甙在一定程度上可以减轻缺血再灌注损伤引起的远期肾脏损害。【关键词】黄芪甲甙；转化生长因子B1TGF一131；单核细胞趋化蛋白LMCP一1；ILI型胶原；缺血再灌注损伤2肾脏缺血再灌注损伤的远期改变发千|砸LONGTERMCONSEQUENCESOFRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINTHERATANDINTERVENTIONRENALISCHAEMIAREPERFUSION岫URYISEVITABLEPATHOPHYSIOLOGICALPROCESSINKIDNEYTRANSPLANTATIONTHEREARESTILLEXISTINGINACUTERENALINJURY,CARDIOPULMONARYRESUSCITATION，CARDIOPULMONARYBYPASSANDOPERATIONWITHRENALARTERYOCCLUSIONALTHOUGHMUCHATTENTIONHASBEENFOCUSEDONEVENTSOCCURRINGDURINGTHEISCHEMICEVENTORINTHEEARLYRECOVERYPHASE，THELONGTERMEFFECTSOFISCHEMICINJURYHAVERECEIVEDLITTLESTUDYRECENTLY,SOMESTUDIESSHOWTHATISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYNOTONLYCAUSEACUTEINJURYBUTALSOLEADTOLONGTERMRENALFUNCTIONDETERIORATIONWEEXPLORETHECONSEQUENCESOFLONGTERMINJURYAFTERISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINRATANDTHEEFFECTOFASTRAGALOSIDEIVONITINPART1，WEOBSERVEWHETHERORNOTASTRAGALOSIDEIVISEFFECTIVEONPREVENTINGRENALINJURYFROMISCHAEMIAREPERFUSIONINJURY，ANDCHOOSEAMOSTEFFECTIVEDOSEFORPART2IFITISWESTUDYTHELONGTERMEFFECTSOFISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINRATSANDTHEEFFECTOFASTRAGALOSIDEIVONITDURINGPART2PART1ADMINISTRATIONOFASTRAGALOSIDEIVPREVENTSRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINRATSPURPOSETOEXPLORETHEEFFECTOFASTRGALOSIDEONRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINIURYINRATSMETHODS30SPRAGUEDAWLEYMALERATS2402609WERERANDOMIZEDINTOMODELGROUP，SHAMGROUPANDTHREEDIFFERENTDOSESOFASTRGALOSIDEIVGROUPSHI曲GROUP，MEDIUMGROUPANDLOWGROUPANIMALSINHIGHGROUP，MEDIUMGROUPANDLOWGROUPWASGIVEN10ASTRGALOSIDEIV5ASTRGALOSIDEIVAND1ASTRGALOSIDE2MLSEPARATELYBYDAILYGAVAGE2HBEFOREOPERATIONFORTHREEDAYS，OTHERGROUPSTREATEDWITHEQUALDOSEOFNORMALSALINEAFTERRIGHTKIDNEYWASREMOVED，THERENALARTERYOFTHELEFTKIDNEYWEREOCCLUDEDWITHAVASCULARCLAMPFOR60MINUTESSERUMCREATININERCRANDRENALTISSUESUPEROXIDEDISMUTASESODACTIVITYANDTULNOARNECROSISFACTORAIPHAFTNF一珏WASMEASURED；PARTIALRENALTISSUESWEREREMOVEDFOR3肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预PATHOLOGICALEXAMINATION24HAFTERREPERFUSIONRESULTSWEOBSERVEDSHAMGROUPSHOWEDFEWRENALPATHOLOGICALCHANGES，HIGHGROUPDECREASESRENALPATHOLOGICALINJURYCOMPAREDWITHTHATOFMODELGROUPANDOTHERASTRGALOSIDE1VGROUPS，WHILEIMPROVESSODACTIVITYF98251035NUGTISSUEANDINHIBITSSEVUNLCR2493249PMOLLANDTNFD334_029NGGTISSUEINRENALTISSUESIGNIFICANTLYCOMPAREDWITHTHATOFMODELGROUPRENALTISSUESOD73084730NUGTISSUE、CR34934335PMOLL、RENALTISSUETNFA7284021NGGTISSUEP005CONCLUSIONSTHESERESULTSSUGGESTTHAT1OASTRGALOSIDEMARKEDLYAMELIORATEDRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURY,POSSIBLYBYIMPROVINGSODACTIVITYANDINHIBITINGTNFQINRENALTISSUEKEYWORDSASTRGALOSIDEIV；ISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYSUPEROXIDEDISMUTASESOD；TUMOURNECROSISFACTORALPHATNF一曲PART2LONGTERMCONSEQUENCESOFRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINTHERATANDEFF佻TOFASTRGALOSIDE1VONITPURPOSETOELUCIDATETHELONGTERMCONSEQUENCESOFRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINTHERATANDEFFECTOFASTRAGALOSIDEIVONITMETHODS54MALESPRAGUEDAWLEYRATS200220曲WERERANDOMIZEDINTOTHREEDIFFERENTGROUPS，ASFOLLOWSRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYGROUPIRI，ASTRGALOSIDEIVGROUPASTRANDCONTROLGROUPSHAM，THEREARETHREESUBGROUPSATDIFFERENTTIMEPOINTSINEACHGROUP，ANDNINESUBGROUPSINTOTAL2MLASTRGALOSIDE1V10GLWASGIVENBYDAILYGAVAGEINASTRGALOSIDEIVGROUPTHREEDAYSPREANDPOSTOPERATION，OTHERGROUPSTREATEDWITHEQUALDOSEOFNORMALSALINEAFTERFIGHTKIDNEYWASREMOVED，THERENALARTERYOFTHELEFTKIDNEYWEREOCCLUDEDWITHAVASCULARCLAMPFOR60MINUTESANIMALSWEREKILLEDAT4，12AND24WEEKSN26，ANDKIDNEYWEREHARVESTEDFORPATHOLOGICSECTIONOBSERVATION，PROTEINANDMRNAEXPRESSIONOFTRANSFORMINGGROWTHFACTOR131TGF131，MONOCYTECHEMOATTRACTANTPROTEINIMCP一1，ED一1ANDCOLLAGENIIIWASMEASUREDBYIMMUNOHISTOCHEMISTRY，MRNAEXPRESSIONWASALSOPERFORMEDBYRTPCREXCEPTED一1MONITORINGPROTEINURIA，SERUMCREATININECR，RATWEIGHTANDRENALWEIGHTWEREALSOPERFORMEDRESULTSTHOUGHRATWEIGHT，RENALWEIGHTANDSERUMCROFIRIGROUPWEREINCREASED4肾脏缺血再灌注损伤的远期改变发干预ONWARD，THEREWERENOSIGNIFICANTLYDIFFERENCECOMPAREDWITHTHATOFSHAMANDASTRGROUPSATTHESAMETIMEPOINTSPO05PATHOLOGICSECTIONOBSERVATIONWASALIKEAMONGTHREEGROUPSATEACHTIMEPOINTSEXCEPTMILDLESIONATRENALTUBEINIRIGROUPOCCASIONALLYANIMALSINIRIGROUPDEVELOPEDPROGRESSIVEPROTEINURIAFROM12WEEKSONWARDSAT24W，EXPRESSIONOFTGFB1MCP1ANDCOLLAGENIIIMRNAANDPROTEINANDNUMBEROFED一1STAININGCELLINTHEINTERSTITIUMINIRIGROUPWERESIGNIFICANTLYINCREASEDCOMPAREDWITHTHATOFSHAMGROUPSP005CONCLUSIONS1AT24WEEKSAFTERRENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURY，INCREASEOFEXPRESSIONOFTGF一131，MCP1ANDCOLLAGENIIIANDINFILTRATIONOFMACROPHAGOCYTEINRENALINTERSTITIUMINDICATETHATTHERATINIRIGROUPHADSHOWEDTHESIGNOFEARLYRENALFIBROSIS2RENALISCHAEMIAREPERFUSIONINJURYINTHERATNOTONLYCANCAUSEANACUTEINJURYBUTALSOLEADTOLONGTERMRENALDAMAGE310ASTRGALOSIDEIVMARKEDLYAMELIORATEDRENALINJURYBYDOWNREGULATIONOFTGFB1，MCP一1ANDCOLLAGENIIIEXPRESSIONANDDECREASEOFINFILTRATIONOFMACROPHAGOCYTEINRENALINTERSTITIUMKEYWORDSASTRGALOSIDEIV，TRANSFORMINGGROWTHFACTORB1TGFB1，MONOCYTECHEMOATTRACTANTPROTEINIMCP一11，COLLAGENILI，ISCHEMIAREPERFUSIONINJURY5肾脏缺JFJLI灌注损伤的远期改变及干预引言肾缺血再灌注损伤IRI是肾脏移植巾不可避免的病理生理过程。同时在临床上，如急性缺血性肾功衰竭、心肺复苏、心脏体外循环、失血性休克、需暂时阻断肾血流的手术等，均可导致肾IRI。临床上可见到部分急性缺血性肾损伤患者血供恢复后。肾功能不能完全恢复、或出现慢性肾功不全【L“，另外目前研究显示移植L肾功能延迟恢复是影响移植肾存活时间的主要原因之一，而L肾IRI是其中重要的非免疫因素15。J。因此，町以推测肾脏IRI不仅可导致近期肾脏损伤而且对远期肾脏功能也有影响。既往的研究对肾IRI本身及早期阶段研究较多，典型的大鼠肾IRI模型动脉夹闭60MIN中肾功能在术后L周可以恢复正常，肾小管上皮在术后1个月或更长时间完全恢复8QO。此时与肾损伤相关的细胞因子也回到基线水平，但对IRL是否造成。肾脏远期的影响研究较少。近年来部分国外学者对此进行了研究。JOSEPLLLJ等选择夹闭肾蒂左60MIN大鼠W3003509肾脏IRI模型，发现在术后16W右肾切除左肾IRI组与保留右肾的相比较肾小球硬化与间质单核细胞浸润均明显增加，同时与肾纤维化明显相关的转化生长因子13ITGF131蛋白和MRNA的表达也明显升高。FORBESLL21等选择夹闭肾蒂左45MIN大鼠W2009肾脏IRI模型的研究表明，在大鼠肾脏IRL64日和180日。肾脏问质ED一1阳性细胞、间质中胶原III明显增加，已有肾纤维化趋势；而JAINL”I等选择夹闭肾蒂右45MIN大鼠W3003509肾脏IRI模型研究显示，大鼠肾脏IRL6个月时尿总蛋白及与肾纤维化明显相关的TGFB1MRNA的表达均明显升高，但肾脏问质中胶原III无明显增加。BASILEIL4J等选择夹闭肾动脉左60MIN大鼠W2509肾脏IRI模型研究显示，大鼠肾脏IRI可以导致肾小管周围毛细血管不可逆损伤从而影响远期肾功能。由于选用的动物模型及实验条件的不同，结论不完全一致。因此有必要对肾IRI的远期改变进行研究。肾纤维化是所有慢性肾脏疾病进展至终末期肾衰竭的共同通路，其病理特征为。肾小球硬化、肾问质纤维化和肾内血管内膜增生。因此，研究肾脏IRI的远期改变也应围绕肾纤维化进行。TGFBL是肾纤维化关键的调节分子【L1“。它不但增加。肾间质细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX，ECM的合成，还能减少ECM的降解，TGFB1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且随剂量的增加，促增殖效应进一步增强。研究表明单核巨噬细胞在肾损伤中起重要作用。不同学者研究发现在大鼠IRI模型中肾组织中有巨噬细胞浸润，并且与远期肾损伤有关IL“19O巨噬细胞能刺激和释放各种促纤维化因子，如血小板源生长因子PDGF、白细胞介素一1ILL、和TGFB1。这些因子可诱导肾脏固有细胞如肾小球平滑肌样系膜细胞、6肾脏缺血冉灌注损伤的远期改变及干预肾间质成纤维细胞、血管周围细胞及肾小管上皮细胞等发生表型转化，活化为成肌纤维细胞MFB，MFB通过合成ECM而促进纤维化的形成。单核细胞趋化因子1MCP一1是较为特异的单核细胞趋化因子，除了趋化单个核细胞外，MCP一1还可能通过诱导巨噬细胞释放溶酶体酶，产生氧自由基以及表达一些促炎凶子来进一步加重组织的炎症反应120J。病理情况下肾小管及问质浸润细胞MCP1的表达上调。ZHU”J等的研究表明IRI可通过NFKBNUCLEARFACTORKAPPAB，NFKB和氧白山基增加使MCPL表达增加进而使单核巨噬细胞浸润增加。RICE221等对成对喂养的大鼠L肾IRI术后动态观察发现，与对照组相比肾IRL术后大鼠肾组织MCP一1的MRNA及蛋白表达明显增加，并且与尿液中MCP一1增加相一致，同时肾组织中巨噬细胞浸润数目增加。肾纤维化其本质是细胞外基质异常堆积，即胶原生成增加和或降解减少，导致有效肾单位减少和肾功能进行性下降。细胞外基质蛋白分为胶原和非胶原两类。胶原是ECM的主要蛋白质成分，约占机体总蛋白的25【2”，主要存在于细胞外基质和基底膜中，胶原含量多少可以直接反映纤维化程度之轻重。在。肾脏中最重要的胶原蛋白是I、III型和型12。L肾小管问质中含有以上3种，但肾小球仅含有III型和型。I型胶原蛋白肾小管间质中沉积是肾纤维化晚期的特征改变。III型胶原是一种纤维胶原蛋白，在间质中大量分布，问质胶原大量增生，导致肾结构的改变，引起肾硬化、纤维化12”。型胶原与糖尿病肾病密切相关26O所以间质中III型胶原表达与肾硬化、纤维化密切相关。因此，我们拟通过建立适当的大鼠肾脏IRL模型观察MCPL、ED1、TGF一01和III型胶原表达的变化及肾组织病理改变了解其远期的影响。再灌注引起的氧自由基大量生成而引发的脂质过氧化和炎性细胞因子释放引起炎症损伤是导致肾组织损伤的重要原因【2。28OIRI的发病基础是能量代谢障碍。在阻断器官血液供应后造成组织缺血和缺氧，三磷酸腺苷ATP合成减少，细胞功能损伤。早期ATP的供应可由无氧酵解补充，但是伴随无氧酵解产生的乳酸堆积、糖原减少、细胞内酸度下降都可加重细胞的损伤。长时间的缺血和缺氧造成ATP供应的进行性减少，引起细胞膜上NAATPASE功能障碍，继发NA十CA”、NAH通道，细胞内钙离子增多，钙离子超负荷，细胞功能受影响。再灌注时组织重新获得血液供应，但是再灌注本身会冲去许多ATP合成的前身物质腺苷、肌苷、次黄嘌呤，使组织失去再合成高能磷酸化合物的物质基础同时再灌注带来的许多分子氧参与形成大量自由基，进一步加重钙超载，引起细胞组织损伤，大量自由基进入细胞核与NFKB作用使趋化因子产生增多在细胞粘附分子等细胞因子参与下引导炎症细胞浸润，浸润的炎症细胞进而释放活性因子如IL1、肿瘤坏死因子TNFA、溶酶体酶，加重组织的炎症反应，同时引发细胞凋亡程序使细胞、组织损伤进一步加重幽J。7肾脏缺血再灌注损伤的远期改变发干预根据I舭的发病机理人们进行多方面的十预研究。如TAKADA31L等用选择素配体清除IRI早期产生的选择素，结果显示实验组较对照组能减轻与肾纤维化相关的细胞凶子如TGFBL、内皮素等的基因表达。另有学者使用血小板激活冈子、内皮素拈抗剂、IL一1、TNFA抑制剂等均具有肾保护作用132。33】。针对氧自由基的抗氧化剂能抑制脂质过氧化，减少氧化剂的产牛并减轻过氧化损伤【34。”】。左旋精氨酸能通过一氧化氮途径调节肾脏血流，有改善IRI的作用I6】。在抑制细胞凋亡和促进细胞功能恢复方面人们使用内皮细胞生长因子EGF、类胰岛素样生长因子IGF一1和松弛素也都有一定的效果P7。”J。外源性的N一酸性糖蛋白AGP和。一抗胰蛋白酵素AAT能在再灌注时抑制细胞凋亡和继发的炎症反应12。针对细胞因子的抗体或生长因子等制备困难、成本较高难于临床使用，研究表明传统的中药如人参、黄芪，当归等对IRI肾脏同样具有保护作用【3”，但由于成分复杂难于深入研究。黄芪甲甙是黄芪的单体之一，除了有抗炎，降压，改善心肌缺血等作用外，近年来研究表明黄芪甲甙有降低血管内皮细胞通透性、抑制巨噬细胞产生TNFA和抗脂质过氧化及清除自由基作用M4】，我们选用黄芪中的有效成分作为单体的黄芪甲甙对IRI大鼠进行干预。肾脏缺IFLLTI灌注损伤的远期改变及干预第一部分黄芪甲甙对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用肾组织缺血再灌注损伤是肾脏移植中不可避免的病理生理过程。同时在临床上，如急性缺血性肾功衰竭、心肺复苏、一TB脏体外循环、失血性休克、需暂时阻断肾血流的手术等，均可导致。肾缺血再灌注损伤。再灌注引起的氧自由基大量生成而引发的脂质过氧化和炎性细胞因子释放引起炎症损伤是导致肾组织损伤的重要原因【2“4“。黄芪甲甙是黄芪中单体之一，除了有抗炎，降压，改善心肌缺血等作用外，还具有抗脂质过氧化及清除自由基作用【4”，我们观察了黄芪甲甙对大鼠肾缺血再灌注损伤的影响。材料和方法1器械显微手术器械上海精密仪器厂无创性血管夹上海精密仪器厂电子天平METTLER瑞典台式电子称北京衡器厂液氮罐上海医疗器械厂移液器GILSON公司产品显微镜OLYMPUS产品恒温孵育箱上海医疗器械五厂组织粉碎机上海施乐仪器厂低温离心机BECKMAN公司产品自动生化分析仪日立公司产品酶标仪BIOTEKELX800分光光度计PHARMACIABIOTECHULTROSPECT200070。C冰箱SIMENZ滤纸，坐标纸，EPPENDEF管2试剂10黄芪甲甙黄芪甲甙109蒸馏水加至100ML震荡混匀10MIN再稀释至5，1。9肾脏缺血冉灌沣损伤的远期改变及干预4多聚甲醛缓冲液多聚甲醛409氢氧化钠29促溶解01MPB自口至1000ML文火加热搅拌至溶液澄清，自然冷却。HARTIS苏术素苏木素精109无水酒精10ML钾明矾209蒸馏水200ML两者混合煮沸后加入059氧化汞搅拌至深紫色，流动冷水冷却后，隔只使用加冰醋酸5ML以延长使用时间。麻醉用药盐酸氯胺酮注射液，上海中西药业股份有限公司。黄芪甲甙纯度为8373，由上海药品检验所提供实验前用生理盐水配制成1、5和10L溶液。图1黄芪甲甙分子式SOD试剂盒购自南京建成生物研究所。大鼠TNFNELISA试剂盒购自晶美生物工程有限公司。3实验动物及分组选用雄性SD大鼠复旦大学医学院实验动物中心提供33只最后完成实验的共30只每组6只，体重240260G，随机分成5组，每组6只肾缺血再灌注组MODEL组假手术组SHAM组黄芪甲甙低剂量组LOW组肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及I预黄芪甲甙中剂量组MEDIUM组黄芪甲甙高剂量组HIGH组各组分别处理如下1LOW组、MEDIUM组和HIGH组按手术前2小时作为时间点，术前3天分别给予黄芪甲甙L、5和10GL溶液2ML灌胃，MODEL组、SHAM组以等量的生理盐水代替。所有动物均从复旦大学医学院动物实验部购得，为清洁级动物。大鼠饲养在室温2730。C的金属笼子中，每笼3只，可自由获取食物和水，室内光线12小时规则变化。动物实验操作在复旦大学附属中山医院泌尿科实验室进行。动物模型的制作术前禁食12小时。氯胺酮腹腔内注射麻醉O1ML509，将麻醉后的SD鼠仰卧位固定于37。C手术台上，剔除腹部皮毛，75酒精消毒腹部皮肤，暴露手术区域。沿腹中线剪开腹部皮肤，钝性分离肌肉，打开腹腔。用无菌生理盐水浸湿的温纱布牵开腹腔脏器，暴露右肾，钝性游离右。肾肾蒂，用0号线结扎肾蒂，切除右。肾。同样方法，暴露左肾。用显微镊小心钝性分离左肾动、静脉，用无创性血管夹阻断左肾动脉，同时开始记时。阻断左肾动脉60分钟后，移去血管夹，恢复肾动脉供血，观察到肾脏在短时内由暗红色逐渐转变为鲜红色提示肾脏恢复血供，并记录肾脏血供完全恢复所用的时间，同时开始记录再灌注时间。逐层关闭腹腔。用75酒精消毒伤口后把大鼠放回鼠笼，予正常饮食和饮水。24H后，再次用氯胺酮麻醉后，打开腹腔，暴露左肾，分离肾包膜，游离肾蒂，血管夹夹住肾蒂，切除左肾。切除的左肾一部分立即在中性缓冲福尔马林液中固定，备用，另一部分放入冷冻管立即置入液氮中，随后转入一70冰箱中备用。从腹腔静脉处用注射器抽取卜15ML血进行肾功能测定，静脉内注射LML空气处死动物。手术中保持无菌操作。4观察指标动物存活率、血供恢复时间肾功能检测血清肌苷CR肾组织中的SOD活力和TNFQ含量肾脏组织病理切片观察肾脏缺MW灌注损伤的远期改变及1，预血清肌苷CR从腹腔静脉处用注射器抽取115ML，去掉针头，注入玻璃试管，离心3000RMIN，3MIN，取上清自动生化分析仪分析由中山医院生化室协助完成。石蜡切片将固定的肾组织剪下约1515CM组织块脱水酒精梯度75酒精、85酒精、90酒精、95酒精、100酒精、100酒精各级酒精脱水时间24H。透明二甲苯15MIN共2次。浸蜡将透明后组织块浸入融化的石蜡巾24H。包埋修整蜡块使切面平整。切片切成厚约45TM1切片。染色脱蜡至水，苏木素5MIN，伊红IMIN。脱水、透明、封片观察。SOD测定原理通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过计算可求出被测样品中的SOD活力。计算公式SOD活力单位定义每MG组织蛋白在IML反应液中SOD抑制率达50时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位NO。SOD活力NUMGPROT对照管A一测定管A对照管A50反应液体积取样量1组织匀浆蛋白含量将一70冻藏的肾组织37水浴LMIN，打开冷冻管取出肾组织，剪下约豆粒大组织块，冰盐水漂洗除去血液，滤纸擦干放置天平称重至500MG置于试管中加入45ML双蒸水，组织粉碎机12000RMIN，15S次，间隔30S连续5次制成10组织匀浆。将匀浆用低温离心机以3000RMIN一1离心10MIN后，取适量上清液移至EPPENDEF管，一部分参照试剂盒提供的方法检测肾组织中的SOD活力，另一部分检测耵QFD含量。肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及I预按SOD试剂盒说明书操作】试剂测定管对照管L号试剂M11010样品2号试剂M1O1O13号试剂M1O1O14号试剂M10101混匀器充分混匀，37。C温水浴40MIN显色剂M122混匀，室温10MIN，波长550NM，LCM光径比色杯比色，蒸馏水调零。最佳取样量109L301150ITL；对照管，测定管各测2次。根据公式对照管一测定管对照管，比值为4850左右的为最佳取样量。经计算LOM30M50蛆均值分别为2968；4063；4716，故50灶1取样量值4716最接近4850应作为最佳取样量。按上表所示每个样品加50肛1，蒸馏水调零，将比色杯置入分光光度计A550检测，各样品均测2次，取平均值。TNFA测定原理选用两种针对TNF一分子不同表位的单克隆抗体，一种单克隆抗体作为包被抗体，另一种单克隆抗体作为酶标抗体，催化底物显色，根据标准品A450值绘制标准曲线，从标准曲线上查出待检标本中TNFA的含量。实验前20MIN从冰箱中取出试剂盒平衡室温标准品加入标准品稀释液10ML至冻干标准品中，彻底溶解后，静置15MIN混匀浓度为2500PGML。按12比例逐个试管配置成分别为2500PGML；833PGML287PGML；93PGML；31PGML；0PGML。肾脏缺血再灌沣损伤的远期改变成千预生物素抗体工作液；酶结合物T作液1200。操作步骤A取出板条，按LOO孔将标准品和标本加入相应孑L中，用胶纸封住反应孑L，37孵箱90MIN。B洗板用力甩尽孔内液体，洗涤液350V1孑B，30S后摔尽液体，厚叠吸水纸上拍下，洗5次。C加入生物素抗体工作液LOO蛆孔，封板，37。C孵箱孵育60MIN。D沈板5次。E加入酶结合物工作液100肛L孔，封板，37。C孵箱孵育60MIN。D沈板5次。G加入显色剂IOOPL孑L，避光37。C孵箱孵育20MIN。H加入终止液100PL孔，混匀后变为黄色即放入酶标仪，测A450值。I每个标本测2次取平均值。标准曲线以标准品浓度作横坐标，A450值为纵坐标。252粤1，5荽1050031932788332500标准品浓度PGM1图2根据TNFA标准品A450值绘制标准曲线5统计学分析实验结果以IKS表示，数据处理使用SSPSLL0进行统计分析，ONEWAYANOVA检验，PO05见表1。肾脏缺血FIF灌注损伤的远期改变发干预表1大鼠肾缺血再灌注恢复血供、手术刚间2姆。2血清CRHI曲组血清CR虽然略高于SHAM组但与MODEL组相比显著降低P005，见表2，图2。表2大鼠肾缺血再灌注24H血清CR和肾组织中SOD活性及TNF一值2妇。50宝4300；8O注表示与MODEL组比较PO05见表2，图3；HIGH组肾组织中TNFA虽然高于SHAM组但与MODEL组相比显著降低P005，见表2，图4。当150竺100PB050呈0图3大鼠肾缺血再灌注肾组织中SOD活性与MODEL组比较P005。提示发生急性肾缺血再灌注前，使用黄芪甲甙有一定的减轻脂质过氧化和清除氧自由基的作用。TNF一是肾缺血再灌注损伤中一种重要的促炎细胞因子【4950O其分子量为17KD，主要由单核细胞、巨噬细胞和内皮细胞产生。通过增强中性粒细胞活性，产生活性氧，血小板活化因子等，引起炎症损伤；同时促进炎性细胞因子释放，放大炎症效应，诱导L肾小球处纤维素沉积，血管收缩，导致肾小球滤过率下降。抑制和中和TNFA对肾缺血再灌注损伤具有保护作用【49。51O近年来研究表明黄肾脏缺M再灌注损伤的远期改变及干预芪甲甙有降低组胺引起的单层血管内皮细胞通透性和抑制巨噬细胞产生TNF一的作用1434。实验结果显示HIGH组血清CR、肾组织中TNFU虽高于SHAM组但明显低于MODEL组PO05见表1。肾脏缺I缸再灌注损伤的远期改变发干预表1大鼠。肾缺血再灌注恢复血供所需时问、手术时问值2坷。2体重和肾重虽然体重和肾重随时间延长而明显增加，但同一时间点各组大鼠之间体重和L肾重无明显差别P005见表2。表2各组大鼠体重和肾重的变化Z姆。笪些竺坚堕壅些塑塑塑至塑坠垄丝工堡3血清CR、尿总蛋白虽然同一组不同时叫点血清CR有一定差别，但同一时间点各组犬鼠之间血清CR无明显差别PO05；IRI组尿蛋白随时闻延长进行性增加，在术后】2W和24W明显高于ASTR和SHAM组P005。见表3；图1。表3，各组大鼠血清CR和尿蛋白的变化2姆。注“与SHAM相比较P005。见表6；图6。12W见附图14；24W见附图15表6各组大鼠肾组织MCP1蛋白、MRNA表达2蜘。注。与SHAM相比较PO05。见表7；图7。24W见附图91表7肾IRI大鼠ED一1阳性细胞计数Z蜘。注“与SHAM相比较P005。见表8，图8。12W见附图10；24W见附图11。III型胶原RNRNA表达随时问延长进行性增加，在24W时明显高于SHAM组和ASTR组PO05。见表8，图9。12W见附图16；24W见附图17。表8各组大鼠肾脏组织III型胶原蛋白、MRNA表达2姆。组别N64W12W24W注“与SHAM相比较P0，05，说明我们建立的动物模型基本排除手术操作引起的日苫IZGIII隧甾副肾脏缺LL再灌注损伤的远期改变及干预干扰，建立的动物模型是可靠的。实验结果显示SHAM组在第4W、12W和24W时，肾功能和形态学均无明显改变。而1RI组随时间改变出现尿总蛋白持续增加，胶原染色加深增厚，并且在第24W时间质胶原染色显著增加；III型胶原蛋白、MRNA的表达均明显升高。提示肾脏1RI不仅可导致近期肾脏损伤而且对远期肾脏功能也有影响。尿蛋白排泄率是预测慢性肾病和终末期肾病进展的最佳独立指标。增加血浆蛋白通过肾小球血管屏障可以损伤肾小管上皮细胞，损伤的上皮细胞进而产生细胞因子和生长因子促进炎症反应、纤维细胞增殖和细胞外基质增生最后导致肾纤维化15。肾纤维化是所有慢性肾脏疾病最终的共同通路，其本质是细胞外基质异常堆积，即胶原生成增加和或降解减少，导致有效L肾单位减少和肾功能进行性下降。胶原是细胞外基质EXTRACELLULARMATRIX，ECM的主要蛋白质成分，约占机体总蛋白的251删，胶原含量多少可以直接反映纤维化程度之轻重。JAINIL驯等研究显示大鼠肾脏IRL6个月时尿总蛋白及与肾纤维化明显相关的TGF一131MRNA的表达均明显升高FORBESI”1等的研究表明在64日和180日肾脏间质中间III型胶原明显增加，已有肾纤维化趋势，上述结果与我们的研究结果相似。我们观察到随时间延长各组TGFB1蛋白、MRNA的表达均有不同程度升高，但在12W和24W时IRI组在同一时间点均较SHAM组明显升高。研究表明TGFDL是肾纤维化关键的调节分子【15171。虽然TGF13L具有损伤组织修复的作用【541，但是其持续的过多表达在进行性肾小球硬化和肾间质纤维化中有重要作用。JOSEP11】对大鼠IRJ模型分成切除右肾与保留右肾，单纯右肾切除和假手术组4组，观察至术后52周，发现仅有切除右肾左肾IRI组出现肾小球硬化，问质纤维化，慢性肾衰伴有TGFB1基因蛋白表达明显增加，其它3组仅出现轻微病变。YASUDA”1等研究发现在肾小球超滤过状态下系膜细胞通过TGFB1上调使细胞外基质增加。肾单位减少可以使血管紧张素II增加进而使小管上皮细胞TGFBL增加【55L。肾损伤间质中巨噬细胞浸润可产生TGFB1。因此TGFBL的持续表达增高意味着有促进肾纤维化可能。我们还观察到在24W时IRI组MCP1蛋白、MRNA的表达及ED1阳性细胞数在同一时间点均较SHAM组明显升高。MCP一1是较为特异的单核细胞趋化因子除了趋化单核细胞外，MCP一1还可能通过诱导巨噬细胞释放溶酶体酶，产生氧自由基以及表达一些促炎因子来进一步加重组织的炎症反应。研究表明尿蛋白量是刺激肾小管上皮细胞MCP1异常分泌的一个重要因素。病理情况下肾小管及间质浸润细胞MCP1的表达上调【2们。ZHU211等的研究表明IRI可通过NFKBNUCLEARFACTORKAPPAB，NFKB和氧自由基增加使MCP一1表达增加进而使单核巨噬细胞浸润增加。RICE221等对成对喂养的大鼠肾IRI术后动态观察发现与对照肾脏缺巾冉灌注损伤的远期改变及十预组相比肾IRI术后大鼠肾组织MCP1的MRNA及蛋白表达明显增加，并且与尿液中MCPL增加相一致，同时肾组织中巨噬细胞浸润数目增加。戴春笋【56I等研究发现，在狼疮性肾炎患者的L肾问质中存在MCP1的大量表达，其肾小管MCP1的表达量与患者间质单核细胞的浸润程度及间质纤维化的程度相关。ED1主要在单核臣噬细胞表达，研究表明单核巨噬细胞在肾损伤中起重要作用。不同学者研究发现在大鼠IRI模型中肾组织中有巨噬细胞浸润，并且与远期肾损伤有关IL“”】。巨噬细胞能刺激和释放各种促纤维化因子，如JFIL小板源生长习TPDGF、13介素一LILL和TGFB1。这些因子可诱导。肾脏固有细胞如肾小球平滑肌样系膜细胞、肾间质成纤维细胞、血管周围细胞及肾小管上皮细胞等发生表型转化，活化为成肌纤维细胞MFB，MFB通过合成ECM而促进纤维化的形成。致纤维化因子在通过上述途径刺激ECM合成的同时还抑制ECM的降解酶系，如TGFB1可抑制胶原酶和基质溶解素的活性，促进金属蛋白酶组织抑制因子一1TISSUEINHIBITORSOFMETALLOPROTEINASES，TIMP1及纤溶酶原激活抑制因子1PALL的表达，从而进一步加速肾组织纤维化的形成。尽管我们的研究发现IRI组ED一1阳性细胞数在24W时明显升高。但其绝对数目偏少，具体原因不清楚。虽然上述结果显示IRI组随时间延长与肾纤维化相关的细胞因子及问质中胶原增加，但是常规病理学切片观察未见特征性肾纤维化改变及肾功能改变。典型的大鼠IRI模型动脉阻断60RAIN术后1W肾功能恢复正常，肾小管上皮细胞完全恢复需4W或更长时间，此时与肾损伤相关的细胞因子也回到基线水平【8。我们的研究结果显示在术后4W各组各项观察指标如肾功能、形态学、胶原染色及TGFB1、MCPL和11I型胶原表达无明显差别，在12W和24W出现不同的增加，尽管我们没有检测4W前的有关指标，上述结果也能从另一个角度说明我们所建立的大鼠IRI模型的可靠性。研究结果中随时间改变各组体重、肾重、及肾组织中MCP1、TGFB1及胶原的表达持续增加，提示是衰老本身的因素在起一定作用。我们观察到使用黄芪甲甙的ASTR组，IRI大鼠在12W和24W时尿总蛋白排出较IRI组减轻，与此同时，大鼠肾组织内MCP1、TGFB1及I型胶原蛋白及其MRNA的表达均有明显下调，间质中ED一1阳性细胞数下降、胶原染色程度减轻，但体重、肾重、血清CR及形态学与SHAM及IRI组相比无明显改变。上述实验结果说明，黄芪甲甙能减轻IRI所引起的大鼠肾脏的远期损害。其保护作用与下调MCP一1、TGFB1及III型胶原蛋白及其MRNA的过度表达，减少间质中巨噬细胞浸润有关。作用机理有3种可能性1直接影响MCP一1、TGFB1及III型胶原的表达、减少问质中巨噬细胞浸润。2通过对IRT的早期保护进而减轻相关细胞因子表达。3两者同时存在。第一种解释目前尚无直接证据。因此以第二肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预种解释较为合理，同时我们观察到的是使用黄芪甲甙的ASTR组整体的损伤减轻，这很难用一种细胞因子或一种细胞来解释，而且它不可能同时对多种细胞因子直接作用。黄芪甲甙是黄芪的单体之一，除了有抗炎，降压，改善心肌缺血等作用外，近年来研究表明黄芪甲甙有降低血管内皮细胞通透性、抑制巨噬细胞产生肿瘤坏死囚子TNFC【和抗脂质过氧化及清除自由基作用4345。陈建等研究表明黄芪通过增加超氧化物歧化酶SOD活性等对大鼠肾IRI的保护作用。罗玉敏126等研究了黄芪甲甙对局灶性脑缺JF】L小鼠脑组织SOD的影响，结果显示应用黄芪甲甙后，缺血各时问点脑SOD活性均显著高于相应的单纯缺血组。研究结果提示黄芪甲甙是黄芪上述作用的活性成分，与我们前面的研究结果一致【5”。因此，黄芪IF_L甙下调尿总蛋白及肾组织巾MCP1、TGFB1及胶原的过度表达与其保护肾组织中SOD活性，抑制TNFA，减轻内皮细胞损伤，降低细胞通透性，进而使蛋白滤过减少，系膜细胞、肾小管上皮细胞产生TGFB1、MCP一1减少有关；同时细胞因子减少使。肾组织内炎性细胞包括巨噬细胞浸润减少，从而减轻肾组织损伤。以上解释仅仅是一种推测，其具体作用机制还需要进一步研究。肾脏IRI不仅可导致近期肾脏损伤而且对远期肾脏功能也有影响。早期有效的干预可以使其造成的损伤减至最低，不仅起到早期肾保护作用也可以使其对远期的不良影响减至最低。我们的研究结果也提示黄芪甲甙在肾IRI保护方面有临床应用的前景。结论1术后24周，IRI组虽然常规病理切片无明显改变但与肾纤维化相关的TGFB1、MCP一1和III型胶原蛋白、MRNA的表达均明显升高，同时肾组织中巨噬细胞浸润数目增加，已有肾纤维化早期改变。2肾脏IRI不仅可导致近期肾脏损伤而且对远期肾脏功能也有影响。3术后24周，10GL黄芪甲甙能够下调TGFB1、MCP1和III型胶原蛋白、MRNA的表达，同时减轻肾组织中巨噬细胞浸润，在一定程度上可以减轻IRI引起的远期肾脏损害。肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预上IRL，中A时，下SHAMHE染色X400附图1IRIL2W各组大鼠肾组织切片观察肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预上ML中ASTR，下SHAMPAS染色400附图2T124W各组大鼠肾组织切片观察肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预上LIRA，中ASTR，下SHAMX400附图3U12W各组大鼠肾组织胶原染色，箭头所指为阳性染色400肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预上埘，中ASTR，下1UIM。附图4取124W各组大鼠肾组织胶原染色，箭头所指为阳性染色X4肾脏缺血再灌注损伤的远期改变及干预上IRI，中ASTR，下SHAMX40