CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜组织中的差异表达

CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜组织中的差异表达,江苏省苏北人民医院耳鼻咽喉头颈外科叶实明 关兵 徐英 冀德君,目录,研究背景,相关研究,问题思考,研究内容,研究结果,研究结论,研究背景,一、变应性鼻炎（allergic rhinitis, AR）是一种发病广泛、呈全球蔓延的鼻腔过敏性疾病，严重困扰着人们生活、工作和学习。发病率在10%25%之间，致病原因主要涉及环境及遗传两个方面，目前治疗主要为抗过敏药物治疗为主。因而，2010年修订的变应性鼻炎及其对哮喘的影响(allergic rhinitis and its impact on asthma，ARIA)将其定义为一种难于治愈但可以长期控制的疾病。1、AR发病需具备三个条件：1、特异性抗原：即引起机体免疫反应的物质，能刺激机体产生相应的抗体或致敏淋巴细胞，而且可以与相应的抗体或致敏淋巴细胞结合产生过敏反应；2、特应性个体：即所谓的过敏体质，具有这种体质的人其特应性抗体形成能力及介质细胞释放活性介质的能力极强；分泌性IgA（SIgA）水平较低或者功能低下；3、特应性抗原与特应性抗体相遇。2、AR发病分为三阶段：致敏阶段、激发阶段和效应阶段（见下图）。,变应性鼻炎发病机制图,二、趋化因子（chemokines, chemoattractant cytokines ，CK）是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子。 1、绝大多数CK有4个保守的半胱氨酸（Cys），根据前两个Cys的相对位置不同，可以分为CX3C、CXC 、CC和C类趋化因子。 2、趋化运动是指细胞向高浓度刺激物方向的定向运动。,趋化因子、受体及靶细胞,CC趋化因子的名称、染色体定位及受体,相关研究,1、2001年Fu-jikura发现组胺能诱导AR患者鼻黏膜中CCL类趋化因子(包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、Rantes)的表达，提示可能存在一个组胺-MCPs轴，在AR发病中起着重要作用。2、2005年国内学者章如新在变应性鼻炎基因表达谱及相关基因研究中，通过基因芯片法检测发现MCP-1(CCL2）、MCP-2(CCL8)、CCR3、CCR7等在变应性患者鼻黏膜组织中高表达，认为CCL2的作用包括激活CD4+和CD8+T细胞的趋化能力,促进嗜碱性粒细胞或肥大细胞释放组胺和白三烯,诱导转化生长因子的产生,提高Th2的极化。,3、2009年在陈德华等一项关于干扰素- 诱 导 的单核因子、单核细胞趋化蛋白 -1 和转化生长因子 -1 在变应性鼻炎的表达的研究中，用ELISA法检测血清中三者含量时发现：变应 性 鼻炎 患 者血 清 MCP-1浓度明显高于健康对照组，推测：MCP-1既介导速发相反应，促进多种炎性介质释放；同时人鼻黏膜中的单核细胞和巨噬细胞可持续分泌MCP-1，并储存于鼻黏膜中，引起嗜碱性粒细胞的组胺释放，从而介导迟发相反应，导致鼻黏膜慢性炎症及高反应性，使鼻部 症状反复持久发作。,问题思考,CCL2与变应性鼻炎发病关系及具体作用途径？考虑到AR是系统性过敏反应的鼻部表现（取AR患者部分鼻黏膜组织）。,目的与方法,目的：明确趋化因子CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜组织中的差异表达并探讨其在发病过程中的作用。方法： 收集2014年1月至2014年3月，江苏省苏北人民医院耳鼻咽喉科住院行手术治疗的AR及单纯鼻中隔偏曲患者，确定AR组患者严格按照AR(2009武夷山标准诊断标准纳入。另选取入院行单纯鼻中隔偏曲矫正的病人为正常对照组。全部病人术前详细询问病史，手术治疗前3周内均未用抗炎、抗组胺药及皮质类固醇激素等药物，行内窥镜检查了解黏膜有无苍白水肿、有无鼻息肉，行变应原皮肤点刺试验测试确定是否有AR。其中AR组2例，正常对照组1例。本研究取材在取得患者本人知情同意的前提下进行。病人资料如下:1号：性别，男；年龄，48岁；正常人（单纯鼻中隔偏曲矫正患者）2号：性别，男；年龄，43岁；AR患者3号：性别，女；年龄，46岁；AR患者,技术手段,分别留取2例变应性鼻炎手术者部分下鼻甲组织及1例正常鼻甲组织作为对照，Trizol法组织总RNA运用分光光度计检测合格后（见表1），送公司进行RNA转录组测序，并进行差异表达分析（基因差异表达分析，差异基因参与的信号转导通路的显著性分析，即KEGG数据库）。,表1 组织总RNA浓度及纯度检测结果,生物信息分析流程图,质量控制,在差异基因筛选中，我们选取FDR=2作为标准，即至少上调2倍或下调至少50%。（FDR表示错误发现率，它是通过对p-value进行校正得到的，作为差异基因筛选取的关键指标）,结果,1.1 本实验其中一例实验组中获得差异表达基因376条，与正常对照组相比，AR组253条基因至少上调2倍，123条基因下调至少50%；另一例实验组中获得差异表达基因659条，与正常对照组相比，AR组274条基因至少上调2倍，385条基因下调至少50%（见表2）。,表2 样品间的差异表达基因数目统计表,1.2 差异表达基因与KEGG数据库对比分析,表3 细胞因子及受体相互作用通路中各差异表达因子及对应RPKM值,细胞因子及受体相互作用通路（cytokine- cytokine receptor interaction）理解,细胞因子及受体相互作用渗透到AR的多个环节，如ThlTh2失衡及二类细胞因子的相互调节、AR的致敏及激发阶段。本研究的IL-6高表达、IL-8的低表达与ThlTh2失衡学说中Th2类细胞因子优势表达相符合。表皮生长因子（EGF）是一类广泛存在于人和动物体内、可促进或抑制多类细胞生长的多肽，国内有关研究提示EGF可促进鼓膜纤维层血管增生以促进鼓膜穿孔的愈合；丁国强、郑春泉的研究发现EGF和EGFR在慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻窦黏膜中均有明显表达。,1.3 TOLL样受体及NOD样受体,NOD样受体(NLR) 和TOLL样受体（TLR）均属于模式识别受体(PRR)，TLR分布在细胞表面和特异的细胞器，主要识别的是胞外微生物，其在识别细胞表面的致敏原进而在过敏反应中发挥重要作用，某些微生物逃避细胞膜PRR进入细胞内，则由NLR进行识别，NLR是存在于细胞浆内的一组蛋白家族，能够介导由细胞内致病原及内源危险信号所引发的保护性免疫反应.,1.3.1 NOD样受体信号通路中各差异表达因子及对应RPKM值,表4 NOD样受体信号通路中各差异表达因子及对应RPKM值,NOD样受体信号通路中各细胞因子差异表达情况的理解,本次实验通过RT-PCR检测结果提示，与正常对照组比较，AR患者鼻甲组织中CCL2的mRNA表达量显著增加。参照KEGG数据库显示CCL2参与的NOD样受体信号通路，同时伴有TH2类细胞因子IL-6表达上调，其中一例实验组显示JUK及Th1类细胞因子IL-8表达下调，我们推测，CCL2参与AR的发病过程，可能在NOD样受体信号通路中起某种作用。,结论,CCL2在变应性鼻炎患者鼻黏膜中表达增强，可能是变应性鼻炎发病及向鼻息肉增生转变的主要因素。,说明