纳米通道电化学单分子分析检测酶分子

分类号学校代码10426密级学号2010052005硕士学位论文MASTERDEGREETHESIS纳米通道电化学单分子分析检测酶分子作者程涛指导教师魏庆莉李雪梅学科专业分析化学专业代码070302研究方向生化分析2013年04月10日纳米通道电化学单分子分析检测酶分子学位论文完成日期2013年04月10日指导教师签字答辩委员会成员签字纳米通道电化学单分子分析检测酶分子摘要单分子检测技术在分析领域的应用十分的广泛，本文主要是应用单分子检测技术研究酶的活性。本文的研究是基于溶血素纳米孔道的单分子电化学检测来讨论限制性核酸内切酶和凝血酶的活性。以溶血素通道为基础，将膜片钳放大技术与电化学检测技术相结合，实现限制性核酸内切酶和凝血酶单分子的检测及传感分析。利用核酸内切酶对特定位点的限制性内切以及凝血酶与凝血酶适体亲和作用的原理，设计了不同的特定的DNA链，通过观察分析限制性核酸内切酶或凝血酶作用于DSDNA后，DNA通过纳米孔道时的微电流变化，从而达到研究限制性核酸内切酶和凝血酶活性的目的。本论文共分为五章第一章，概述了纳米通道、核酸内切酶以及纳米粒子的简介及作用并简单介绍了单分子检测技术、凝胶电泳技术以及膜片钳放大检测技术等分析方法。着重对单分子检测技术和纳米通道进行了说明，对单分子检测技术的前景做了介绍。第二章，采用单分子电化学检测初步研究了DNA测序工作，主要研究了限制性内切酶的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链DNA和双链DNA通过孔径时不同的电流下降，来初步对DNA测序工作进行了解。在限制性内切酶的作用下双链DNA能顺利的通过纳米孔道，通过对比限制性内切酶作用前后电流的变化进而对限制性内切酶的活性进行研究。第三章，通过凝胶电泳技术和纳米金标记DNA在TEM下的图像来研究限制性核酸内切酶的活性，以及错配碱基T与T在HG2条件下能形成THGT的稳定存在。首先通过限制性内切酶作用前后的DNA在凝胶电泳下进行分离，观察分离的情况来研究限制性内切酶的，其次当DNA被纳米金修饰后，观察在限制性内切酶作用前后，DNA上修饰的纳米金在TEM表征下的不同来研究限制性内切酶的活性。同时在以上的实验中剪切位点有错配碱基T与T的时候，限制性内切酶不能作用，只有当在HG2条件下，形成THGT的稳定结构后，限制性内切酶才能发生作用。第四章，通过溶血素纳米孔道研究凝血酶单分子的活性。通过用溶血素和卵磷脂的自由组装形成生物纳米孔道，利用溶血素孔径的特性来控制单链DNA和双链DNA通过孔径时不同的电流下降。研究了凝血酶与是凝血酶适体的亲和作用，当凝血酶作用下的SSDNA才能顺利的通过溶血素纳米孔道，同时也研究了颈环结构的解链时间与电压的关系。利用核酸适体实现单个酶分子的检测，对单个酶分子的实时生物化学反应和酶催化动力学进行研究，研究单个酶分子在许多非特异性结合位点中如何找到特异性位点，为解决生命科学中的重大问题提供理论依据。第五章，结论部分，对全文内容进行了总结。关键词核酸内切酶；凝血酶；单分子检测；溶血素；纳米通道ELECTROCHEEMICALDETECTIONGOFSINGLEENZYMEMOLECULESBASEDONNANOCHANNELABSTRACTTHETECHNOLOGYOFSINGLEMOLECULEDETECTIONISWIDELYAPPLIEDINTHEFIELDOFANALYSIS,THISPAPERMAINLYRESEARCHSTHEACTIVITYOFENZYMEBYTHETECHNOLOGYOFSINGLEMOLECULEDETECTIONTHERESEARCHOFTHISPAPERISBASEDONTHESINGLEMOLECULARELECTROCHEMICALDETECTIONOFHEMOLYSINNANOPORESTODISCUSSTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENDONUCLEASEANDTHROMBINUSINGTHEPRINCIPLEOFENDONUCLEASESRESTRICTIONOFASPECIFICSITEANDTHEAFFINITYFUNCTIONOFTHROMBINANDTHROMBINAPTAMER,THEDIFFERENTSPECIFICDNACHAINSAREDESIGNEDWHENRESTRICTIONENDONUCLEASEORTHROMBINACTSONTHEDSDNA,THEMICROELECTRICCURRENTWHENDNATHROUGHINGNANOPORESWILLBEDIFFERENT,SOASTOACHIEVETHEPURPOSEOFRESEARCHINGTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENDONUCLEASEANDTHROMBINTHISTHESISISDIVIDEDINTOFIVECHAPTERSTHEFIRSTCHAPTER,THISPAPERSUMMARIZESTHEINTRODUCTIONANDFUNCTIONOFNANOCHANNEL,ENDONUCLEASEANDNANOPARTICLESOFANDSIMPLYINTRODUCESTHEANALYTICALMETHODOFSINGLEMOLECULEDETECTION,MICROGELELECTROPHORESISSANDTHEPATCHCLAMPAMPLIFIERDETECTIONTHISPAPERESPECIALLYILLUSTRATESTHESINGLEMOLECULEDETECTIONANDNANOCHANNEL,ATTHESAMETIMETHEPROSPECTSOFTHESINGLEMOLECULEDETECTIONISPRESENTEDTHESECONDCHAPTER,THESINGLEMOLECULEDETECTIONISUSEDTOPRELIMINARYSTUDYTHEDNASEQUENCINGANDMAINLYSTUDYTHEACTIVITYOFRESTRICTIONENZYMESUSINGTHECHARACTERISTICSOFHEMOLYSINAPERTURETOCONTROLTHEDIFFERENTCURRENTWHENTHESINGLESTRANDDNAANDDOUBLESTRANDEDDNATHROUGHTHEPORE,THISPAPERPRELIMINARYUNDERSTANDSTHEDNASEQUENCEBYUSINGTHEBIOLOGICALNANOPORESOFHEMOLYSINANDLECITHINFREEASSEMBEDUNDERTHEACTIONOFRESTRICTIONENZYMES,THEDOUBLESTRANDEDDNACANSMOOTHLYTHROUGHTHENANOPOREBYCOMPARINGTHECURRENTCHANGEBEFOREANDAFTERRESTRICTIONENZYMESFUNCTION,THERESTRICTIONENZYMESACTIVITYISSTUDIEDTHETHIRDCHAPTER,BYMICROGELELECTROPHORESISSTECHNOLOGYANDTHETHETEMIMAGESOFDNATAGGEDBYAUNPS,THERESTRICTIVEENDONUCLEASESACTIVITYISSTUDIED,ASWELLASTHEMISMATCHBASETANDTCANSTABLYEXISTUNDERTHECONDITIONOFHG2FIRSTLYSTUDINGTHEACTIVITYOFTHERESTRICTIONENZYMEBYOBSERVINGTHESEPARATION,WHICHISTHEDNAUNDERTHEMICROGELELECTROPHORESISSBEFOREANDAFTETHERESTRICTIONENZYMESACTIONSECONDLYAFTERTHEDNAISTAGGEDBYAUNPS,STUDINGTHEACTIVITYOFTHERESTRICTIONENZYMEBYOBSERVINGNANOPARTICLESSDIFFERENTCHARACTERSINTEMATTHESAMETIMEINTHEABOVEEXPERIMENTS,WHICHHAVEMISMATCHBASETANDTTHERESTRICTIONENZYMESCANNOTACTONTHEDNAONLYWHENUNDERTHECONDITIONOFHG2,FORMEDTHESTABLESTRUCTUREOFTHGT,THERESTRICTIONENZYMESCANWORKTHEFOURTHCHAPTER,THROUGHTHEHEMOLYSINNANOPORES,THEACTIVITYOFTHROMBINMOLECULEISSTUDIEDUSINGTHECHARACTERISTICSOFHEMOLYSINAPERTURETOCONTROLTHEDIFFERENTCURRENTWHENTHESINGLESTRANDDNAANDDOUBLESTRANDEDDNATHROUGHTHEPORE,THISPAPERPRELIMINARYUNDERSTANDSTHEDNASEQUENCEBYUSINGTHEBIOLOGICALNANOPORESOFHEMOLYSINANDLECITHINFREEASSEMBEDTHISPAPERRESEARCHSTHEAFFINITYOFTHROMBINANDTHROMBINAPTAMERWHENUNDERTHEACTIONOFTHROMBIN,THESSDNACANSMOOTHLYTHROUGHTHEHEMOLYSINNANOPORESATTHESAMETIME,THETIMEOFMELTINGTHECHAINSOFNECKRINGSTRUCTUREISRELEVANTTOTHEVOLTAGETHEFIFTHCHAPTER,ITWASSUMMARIZEDFORTHEWHOLETHESISKEYWORDSENDONUCLEASETHROMBINSINGLEMOLECULEDETECTIONHEMOLYSINNANOCHANNEL目录第一章绪论11纳米通道111自然态的通道1111生物膜离子通道1112溶血素跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道112人工合成的通道22核酸内切酶321核酸内切酶简介322核酸内切酶的分类323限制性核酸内切酶作用324限制性内切酶的性质及应用43单分子检测（SINGLEMOLECULESDETECTION,SMD）531DNA简介5311DNA的成分5312DNA的空间结构5313DNA的稳定性632适体7321适体简介7322适体的特点733单分子检测的分类8331光谱分析法8332电化学检测法8333生物动力学工具法9334单分子检测的应用前景94纳米粒子1141纳米粒子简介11411纳米粒子的性质1142纳米金粒子1243二氧化铈纳米粒子135凝胶电泳分析1551电泳简介15511电泳技术与应用15512聚丙烯酰胺凝胶电泳156膜片钳放大检测技术1761膜片钳技术简介1762电压钳位1763单通道电流记录177立题依据和研究内容18第二章基于溶血素纳米孔道检测NBBBVCI内切酶单分子191前言192实验部分2021试剂与仪器20211主要试剂20212仪器装置2022实验方法21221DNA储备液及缓冲溶液21222样品的制备21223卵磷脂的处理21224仪器操作21225制备磷脂双分子层膜21226在磷脂双分子层膜上形成纳米孔道22227检测P1、P2、P3通过纳米孔道时的电流信号233结果与讨论2431实验原理2432实验过程26321检测P1穿过纳米孔道时的电流变化26322检测P2穿过纳米孔道时的电流变化28323检测P3穿过纳米孔道时的电流变化2933讨论P1、P2、P3穿过纳米孔道时的电流脉冲304小结33第三章基于纳米金胶标记DNA的电化学检测341前言342实验部分3521试剂与仪器35211主要试剂35212仪器装置3522实验方法36221纳米金胶的制备36223凝胶电泳样品的制备36224透射电子显微镜分析（TEM）的样品的制备362241巯基DNA的前处理与修饰362242制备TEM的样品373结果与讨论3831实验原理3832利用凝胶电泳分离DNA38321制胶383211制备30凝胶383212制得50TAE缓冲液383213固定凝胶38322凝胶电泳分离DNA3933利用TEM表征反应前后的溶液41331纳米金溶液TEM表征41332G1、G2的TEM表征42333G3、G4的TEM表征43334G5、G6的TEM表征444小结47第四章基于溶血素纳米孔道检测凝血酶单分子481前言482实验部分4921试剂与仪器49211主要试剂49212仪器装置4922实验方法50221DNA储备液及缓冲溶液50222样品的制备50223卵磷脂的处理50224仪器操作50225制备磷脂双分子层膜50226在磷脂双分子层膜上形成纳米孔道5123实验原理5124检测颈环结构S1穿过溶血素孔道的电流信号5225检测凝血酶加入前后杂交颈环DNA穿过溶血素孔道的电流信号5426讨论G1、G2、G3穿过纳米孔道时的电流脉冲553小结59第五章结论60参考文献61致谢65附录攻读硕士学位期间已发表和待发表的学术论文目录66独创性声明67第一章绪论1纳米通道纳米孔一般定义为内径为1100NM的微孔，若孔的深度远大于孔径，就称之为纳米孔道，一般孔径应大于洞孔深度，或者处于同一量级。纳米通道根据其形成方式可以分为自然态的通道以及人工合成的通道。11自然态的通道111生物膜离子通道离子通道依据其活化的方式不同，可分两类一类是电压活化的通道，即通道的开放受膜电位的控制，如NA、CA、CL和一些类型的K通道；另一类是化学物活化的通道，即靠化学物与膜上受体相互作用而活化的通道，如ACH受体通道、氨基酸受体通道、CA活化的K通道等。活体细胞不停地进行新陈代谢活动，就必须不断地与周围环境进行物质交换，而细胞膜上的离子通道就是这种物质交换的重要途径人们已经知道，大多数对生命具有重要意义的物质都是水溶性的，如各种离子，糖类等，它们需要进入细胞，而生命活动中产生的水溶性废物也要离开细胞，它们出入的通道就是细胞膜上的离子通道。生物膜离子通道是各种无机离子跨膜被动运输的通路。生物膜对无机离子的跨膜运输主要有被动运输和主动运输两种方式。被动运输的通路称离子通道，主动运输的离子载体称为离子泵。生物膜对离子的通透性与多种生命活动过程密切相关。例如，感受器电位的发生，神经兴奋与传导和中枢神经系统的调控功能，心脏搏动，平滑肌蠕动，骨骼肌收缩，激素分泌，光合作用和氧化磷酸化过程中跨膜质子梯度的形成等。112溶血素跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道溶血素可以与磷脂双子层自组装形成自然态的生物纳米孔道。溶血素的内部孔道是刚性的，它可以使得小型的离子和带电的分子通过，对于大分子物质是不能通过的，因此以溶血素纳米孔为基础的生物膜在电化学检测池中可以降电化学检测池分割成由微孔相连的两个部分。在一定的电压下带电的离子或带电微型分子可以定向地从通道内通过。不同的电压下，孔道内的电流是不一样的，当DNA或者RNA分子穿过时会产生下降电流，同时会有下降的脉冲，脉冲的宽度与链的长短成正比的，而且通过纳米孔道时，脉冲的数量、时间等与组成DNA或RNA的碱基数量有关。生物大分子在外界压力下穿过由玻璃等绝缘材料制作的纳米孔或生物纳米孔时会导致通过小孔离子流的阻塞，小孔电导率的瞬时变化反应了这个过程，电流的减低量反映粒子的体积大小，而电流变化的次数则反映生物大分子的数目。12人工合成的通道尽管溶血素孔能够满足生物大分子的研究，但是由于其自身性质的原因注定其本身的不稳定性，使得形成的纳米孔道同样寿命比较短而且自身的孔径的控制比较局限，这就促使人们对新一类的纳米孔道的探索1。固态纳米孔道具有孔径稳定，物理性能良好等优势。常用的固态纳米孔道是应用SI3N4晶体膜。制造固态纳米孔道的技术里最常见的是聚焦粒子束技术，它专门应用于光刻掩模版修补和集成电路修饰。人工合成的纳米通道还有碳纳米管、聚合膜通道、AL2O3膜通道，其中碳纳米管通道在目前应用比较广泛，碳纳米管的研究主要是基于石墨烯的研究，目前对于石墨烯的研究越来越多，在各个领域都有相关的报道，因此人工制造的碳纳米管纳米通道成了现在单分子检测的热点。2核酸内切酶21核酸内切酶简介内切酶，即限制性核酸内切酶，亦称限制性核酸酶。它是一种能催化多核苷酸的链断裂的酶，只对脱氧核糖核酸内一定碱基序列中特定位置发生作用，把这位置的链切开。通过内切酶可以把某一个遗传基因片段剪切下来，若再连接在别的生物细胞的遗传基因上，便可使这生物细胞具有新的遗传特性。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。现在人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。限制性酶的功能是在DNA分子的内部拆卸水解，甲基化酶作用是修饰，DNA分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。22核酸内切酶的分类核酸内切酶主要分为三类内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的；内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子；内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。23限制性核酸内切酶作用限制性核酸内切酶（以下简称限制性酶）是一类识别双链DNA中特定核苷酸序列的DNA水解酶，以内切方式水解DNA，产生5P和3OH末端。1952年LURIA等及1953年BERTANI等研究噬菌体时发现了宿主控制性现象。ARBER及其同事用放射性同位素标记证明，噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解，但宿主自己的DNA并不降解，据此他们提出了限制性修饰酶假说。对于一个宿主细胞，限制性酶及DNA甲基化酶是其细胞中的一对酶，它们对DNA底物有相同的识别顺序，但有相反的生物功能，限制性酶的功能是在DNA分子内部拆卸水解，甲基化酶是修饰，DNA分子经修饰后，就可逃避限制性酶的识别，而甲基化酶只修饰宿主自身的DNA，从而避免了限制性酶对自身DNA的破坏。24限制性内切酶的性质及应用限制性内切酶是一种生物蛋白。限制性内切酶储存在含50的甘油缓冲液中，酶切时甘油的浓度不应超过1/10体积。否则对酶活性有抑制作用。限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、PH等条件下才表现最佳的切割能力和位点的专一性，所以要用专一的反应缓冲溶液。随着科学技术的发展限制性内切酶广泛应用于很多领域如DNA测序、微生物的DNA分析、DNA切割技术、DNA的重组等。限制性核酸内切酶在分子生物学研究中占有极其重要的地位，几乎每一个研究领域都离不开限制性内切酶，其应用非常广泛，如病原微生物DNA分析；DNA序列分析，将庞大的DNA分子切割成小片段便于序列分析；DNA重组和组建新质粒；建立DNA的物理图谱等。3单分子检测（SINGLEMOLECULESDETECTION,SMD）单分子检测是一种在分子水平上检测灵敏度达到极限的技术，是对低含量物质检测起着至关重要的技术2。单分子检测技术为分析化学的检测提供了很多的可能性，极其有效的推动着分析化学的进展，目前单分子检测技术在分析化学领域已经取得了不少的成果。单分子检测不仅可以对不均匀的体系中的单个分子进行识别，同时也能对其进行分类、定量分析，同时它对生物大分子的结构和功能也能提供很多的重要信息。单分子检测技术以其独特的优势将在分析化学、生物、医药、纳米分析等领域开辟新的路径和科研手段35。31DNA简介1954年4月DNA双螺旋提出后，整个生物学界呈现出少有的五彩缤纷的景象，被认为是20世纪以来生物科学中最伟大的成果，是生物学史上一个新纪元，为生物科学，农业科学，医学的发展开辟了新天地。生化方面在21世纪吸引无数眼球的热门词汇比如人类基因组计划、基因芯片、个性化疯子诊断、生物云计算，这些都和DNA测序有很大的关系