【基金标书】2010CB912400-基于冷冻电子显微镜学的生物大分子的高时空分辨率的结构和功能研究

项目名称： 基于冷冻电子显微镜学的生物大分子的高时空分辨率的结构和功能研究 首席科学家： 高海啸 清华大学 起止年限： 2010 年 1 月 8 月 依托部门： 教育部 一、研究内容 本项目将进行以下几个方面的研究 : 课题一 ，高通量、全自动化的冷冻电镜数据采集和三维重构图像处理方法的研究 a. 开发高通量、全自动化的电镜数据采集和处理方法 , 以及高性能的三维重构算法 在冷冻电镜结构解析工作中，目前有相当大的一部分时间和人工都消耗在重复性工作中，例如电镜胶片的拍摄和扫描，电镜图像的预 筛选，三维重构计算中的某些步骤等。近年来，随着冷冻电子显微学的蓬勃发展，可以达到的分辨率越来越高，相应地对电镜数据量的需求也越来越大。以核糖体结构解析为例，获得10 分辨率的核糖体结构需要 10 万个冷冻电镜单颗粒。而在理论上，获得原子分辨率（好于 3）则至少需要 100 万个单颗粒电镜图像。如果以目前普遍使用的手动方式来进行数据采集和处理，那么仅仅 电镜胶片的拍摄、扫描，以及电镜图像的预筛选等工作就需要数月之久！ 这实际上已经成为阻碍当前高分辨率的冷冻电镜结构解析的主要瓶颈之一。解决这一问题的有效途径就是开发高通量、 全自动化的电镜数据采集和处理方法以及高性能的三维重构算法，以最大程度地提高对超大电镜数据量的采集和处理的效率，减少在这些方面耗费的人工和时间。 自动化的电镜数据采集系统对电镜的稳定性和计算机控制下的可操作性要求很高。特别是开发基于单颗粒重构方法的自动化采集系统，要求能够自动识别大量的适合成像的样品区域并长时间持续监控。由于开发难度很高，目前国际上在这一前沿领域的工作才刚刚开始，而真正能够实现全自动化数据采集的系统更是屈指可数。由本项目研究人员雷建林教授在过去数年中主持开发的其中的佼佼 者 。与传统的手工采集方法相比， 巨大优势是能够对单个样品进行长达数日甚至数周的持续数据采集。以多输出通道的 4机为例， 24 小时内可至少收集 2000 张电镜照片，比手工采集效率高十倍以上。此外， 能自动地在低电子辐照剂量下根据样品情况选择在同一个孔洞中的不同区域多次拍摄，从而大大提高了样品的利用率。而这在手工电镜数据采集中是无法做到的。 前已经在哥伦比亚大学、德州大学休斯顿医学中心、哈佛大学等多家冷冻电镜研究机构全面运转或试运转，并已多次稳定地对单个样品进行数据采集一周以上，迄今共收集十余万张片。 在本课题中，我们将在 有的核心构架的基础上，开发一套完备的高通量和全自动化的电 镜数据采集和处理系统。首先，针对目前只能运行在美国 司的 列冷冻电镜上的限制 ， 将其扩展到我们刚刚在清华大学和中科院生物物理所购置的 冻电镜平台上。需要指出的是，目前还没有任何针对 冻电镜的自动化数据采集系统。我们在这方面的工作将是国际上最前沿的。 其次， 将 展至 具有支持单颗粒采集，倾转系列数据采集（包括电子断层分析和单颗粒倾转）等多项重要冷冻电镜操作功能。最后，在自动化数据采集的基础上，实现对电镜数据的 预处理、预筛选，并由此探索和优化电镜样品的理想处理和数据收集条件，如包埋冰层的最佳厚度、电子束的最佳辐照强度和最佳欠焦范围等。 冷冻电镜图像的三维重构有很高的计算需求，特别是其中 计算部。在 10 年前，这些计算任务主要是在具有共享内存架构和多处理器的专用计算机上完成。随着对分辨率的要求越来越高，所需要处理的电镜图像的数量呈指数增长趋势。因此，过去那种依赖于昂贵的专用计算机的数据处理方式已不再可行，而需要采用以 操作系统的计算机集群。在本课题中，我们将 会针对高性能并行化这一需求对相关三维重构算法进行优化。以目前在国际冷冻电镜领域应用最广泛的三维重构系统 为核心，开发自动化的电镜数据处理系统。并将利用数据库集中管理从样品制备、电镜数据采集、数据分析、一直到三维重构的全套过程，以实现对一个完整的电镜结构解析项目的高效管理和处理。 b. 开发和优化 结构不均一 性存在条件下的高性能分类方法，并应用于研究生物大分子复合体的动态过程和功能 结构不均一 性是指由于生物大分子复合体自身结构的内在灵活性，在采集到的同一组冷冻电镜数据中经常包含着它们不同的结构构象。目前 ，结构 不均一 性影响冷冻电镜结构的分辨率已是一个普遍存在的问题 。这主要是由于生物大分子复合体往往有多个与功能相关的结构共存，通过实验手段很难将它们分离。 因而在采集到的冷冻电镜 照片中，不同的单颗粒可能代表不同的功能态结构，它们之间结构的差异将直接降低三维 重构密度图的分辨率。在严重情况下，甚至会导致局部密度图残缺。 当前，冷 冻电子显微学领域的一个重要研究热点 就是针对结构不均一 性的成熟的、普适的分类方法的研发 。利用冷冻 电镜数据 中丰富的内在结构信息，将存在结构不均一 性的冷冻电镜数据在三维重构前进行分类。目前采用的分类方法主要分为两类， 即 监督性方法和非监督性方法。前者的特点是快速、简便，但是必须引入合适的参考结构（ 。分类结果的优劣往往取决于参考结构选取的好坏。在冷冻电子显微学领域，现有的分类方法的研究工作大都属于这一类，主要是基于交叉关联函数的监督性分类方法。由于监督性分类方法对预先引入的参照结构要求较高，在使用不当的情况下常常会导致分类后的结构出现偏差甚至错误，因 此开发有效的非监督性分类方法来解决 冷冻电镜中的生物大分子结构不均一 性尤为重要。然而，由于冷冻电镜数据的信噪比极低，加之采集到的电镜照片中的单颗粒的投影方向有待确定，使得分类问题变得非常复杂。目前，针对非监督性分类方法的研究工作大多还只是在尝试阶段。其中，由本课题负责人高海啸教授参与开发的 基于最大似然法的 分类方 法，是目前唯一一个在实践中得到运用的非监督性分类方法 。在本课题中， 我们将在过去的 分类 方法的 研究工作基础上，针对性地选择具体的生物大分子复合体作为研究体系，通过提高和完善现有的监督性和非监督性方法的独立性和普适性，包括改善已有监督性方法对参照对象的过度依赖，建立有效的分类检验算法等，进一步尝试开发全新高效的冷冻电镜数据分类方法。 课题 二， 低对称或非对称性的生物大分子复合体的高分辨结构及其动态过程的研究 细胞中所有的重大生命过程都离不开生物大分子的参与。生物大分子发挥功能需要其它生物分子的协同作用，形成稳定的或者不稳定过渡态的复合体。这些大分子复合体通常都处 于一个动态的变化过程，为它们的高分辨结构的解析带来了很大困难。本课题将在课题一的基础之上，利用单颗粒重构技术解析几类与重大生命过程相关的生物大分子复合体的高分辨结构，包括一些细胞内可溶的大分子复合体（如核糖体）、膜蛋白或者与膜相关联的蛋白、以及与人类疾病和健康密切相关的细胞膜上受体与配基复合物（如细胞因子 /受体复合物）。 a. 细胞内可溶性生物大分子复合体（核糖体等）的结构和功能的研究 冷冻电子显微学在分子机器的研究中已经应用得非常广泛。以 蛋白质的过程为例，从 复制、转录、 剪切、以至蛋白 质的合成这一系列连续的遗传信息传递过程中，冷冻电子显微学都有着重要的贡献。例如，真核细胞的 已经有中等分辨率（ 1冷冻电镜结构。我们将会以核糖体的高分辨功能态结构为重点，同时展开对细胞中其它的一些重要分子机器的结构解析，如蛋白酶体和各种分子伴侣复合体等。 自 2000 年核糖体的大小亚基分别被解析以来，在过去的十年中，核糖体的晶体学研究取得了巨大的进展。迄今已经有 T. 两个原子分辨率的 70S 核糖体被解析。尽管这些晶体结构提供了丰富的核糖体结构信息，目前对详细的蛋白合成分子机理却仍未完全清楚。这主要是由于蛋白质翻译是一个高度动态的过程，每一步都有许多蛋白翻译因子参与并与核糖体相互作用。迄今为止，只有 三个因子和核糖体所形成的复合体的晶体结构被解析 。与之形成对照的是，冷冻电子显微学已经成功解析出原核细胞的核糖体和所有翻译因子形成的各种复合体的三维结构，些冷冻电镜结构不仅大大地丰富了我们对蛋白合成的动态过程的理解，而且通过将核糖体高分辨的晶体结构 “嵌入 ”到这些不同功能态下的电镜三维重构图中，还可以构建出一系列准原子分辨率的功能态结构模型。 我们拟从以下几个方面开展针对核糖体的结构和功能的研究：（ 1）建立一个高效的、受控的核糖体体外转录体系。分离纯化核糖体的大小亚基以及所有翻译因子，在体外 模拟体内的翻译过程，精确控制核糖体复合体停留在指定的功能态，为下一步的冷冻电镜结构解析提供优质样品。并在这一系统的基础上，采用生物化学的方法研究蛋白翻译过程中几个悬而未决的问题，比如在延伸过程中， 解的作用到底是什么等。（ 2）核糖体的多种功能态的高分辨结构解析。在课题一的研究基础上，采用高通量的冷冻电镜方法，解析高分辨率的核糖体的多种功能态结构，然后通过分子动力学手段，构建准原子分辨率的各种功能态模型，从而揭示蛋白质翻译步骤中的分子机理。（ 3）核糖体的生物起源过程 的相关功能和结构研究，如原核生物核糖体的组装过程中的一系列的酶催化反应。在这些反应中，大小亚基前体中的 修剪和修饰。我们将在体外构建包含这些酶因子（如 及 ）的核糖体复合体，解析它们的三维结构，从而了解这些酶和核糖体亚基之间的相互作用，并根据获得的三维信息，进一步设计生物实验，以深入开展相关的功能性研究。 b. 膜蛋白复合体的结构和功能的研究 人类的很多重大疾病包括神经系统疾病、心血管疾病、呼吸系统疾病等都和膜蛋白密切相关。对膜蛋白的结构和功 能的深入研究是我们进一步了解这些疾病的分子成因以及设计针对性药物的基础。迄今为止，只有大约 300 多个膜蛋白的结构被解析，还远不到已知蛋白质数据库中收录中所有结构的 1%。 膜蛋白及其复合体三维结构的解析，以及其结构与功能关系的研究是目前蛋白质科学研究的难题和热点。 而，多数膜蛋白是以复合体的形式发挥功能，由嵌入膜内的疏水部分（或者亚基）和伸在膜外的亲水部分（或亚基）组成兼性 蛋白复合体，如数量众多的跨膜转运蛋白复合体、膜蛋白受体、核膜上的核孔复合体等。这 些膜蛋白复合体一般是由几个或者几十个蛋白组成，而且在执行功能的时候寡聚结构状态可能发生改变。尽管膜蛋白复合体的局部结构可以通过 是其整体组装和动态的结构变化，却需要借助独具手段的单颗粒冷冻电子显微学来进行研究。国际上综合运用 如对细胞因子 膜上受体复合物的研究。 我们拟从以下三个方面开展工作：（ 1）针对 样品制备、电镜图像处理以及图像筛选等方面，开展膜蛋白复合体的单颗粒三维重构的方法学研究。（ 2） 细胞膜上受体与配基复合物的结构和功能的研究。我们将结合单颗粒冷冻电子显微学及白细胞介素 族细胞因子与受体复合物为目标，开展结构解析以及结构与功能关系的研究工作。目前为止，已发现的白细胞介素 族分子有 11 个，其中研究最为深入的包括 些细胞因子具有广泛的生物活性，在机体免疫应答、炎症、自身免疫和组织损伤过程中起着重要作用。它们还与 许多疾病的病理过程相关，如败血性休克、风湿性关节炎、炎症性肠部疾病、发热等 ）。 族细胞因子的作用是通过细胞膜上的受体分子介导，进而诱发胞内的多条信号传导通路。目前已知的 体分子包括 。 族细胞因子与受体组成三元复合物，例如 作用通过受体 导， 受体分子包括 与 受体分子包括 这些 族细胞因子 与受体三元复合物的单颗粒冷冻电镜及 号从胞外传导至胞内的完整画面，也为以号通路为靶标的药物设计在配基受体结合点上提供了结构基础。（ 3）开展对 白复合体、 白复合体及镁离子转运通道蛋白寡聚体等膜蛋白复合体的整体结构的单颗粒解析以及结构与功能关系的研究。其中，白复合体（约 450逆转录病毒颗粒的出芽中起关键作用，与阿尔茨海默（ 及 毒感染有关。 白复合体由 一种典型的急性期蛋白复合体，参与人的炎症反应，在免疫系统反应及抑制动脉粥状硬化（ 挥重要功能。而镁离子转运通道蛋白寡聚体 参与镁离子跨膜转运的主要系统之一，维持细胞正常的生命活动所必需的。 课题 三， 高对称性生物大分子复合体的高分辨结构及其动态过程的研究 生物大分子复合体的对称性在自然界中普遍存在，例如十四次对称的十六次对称的真核细胞核蛋白 二面体对称的丙酮酸盐脱氢酶复合体，八面体对称的大肠杆菌蛋白 及和二十面体对称的很多病毒壳等。单 一生物大分子复合体中也可能存在多种不同对称性，如噬菌体的头部呈二十面体对称性，通过十二或十三次对称的连接蛋白联接六次对称的尾部。生物大分子复合体的高对称性组装一方面反映了基因信息的高效经济利用，另一方面也显示了复合体功能过程中的协同作用机制。在客观上，这些高对称性的存在使得高分辨率结构的获得变得相对容易。例如，具有 n 次对称的大分子复合体在某个取向（如果不在 m 对称轴线上）的透射电子投影图像所能获取的信息也同时包含了其它 对称相关方向取向的电子图像信息；而通过 m 对称轴线的成像，也同时包含有（ n/ 其它 m 对称轴线方向的信息。在多面体大分子复合体的取向和中心位置确定上，目前一个常用方法是通过搜索等价线（ 位置来实现 。 高对称性的存在相应增加了与对称性相关的等价线条数，从而大大提高了等价线定位的精度。因此，相对于低对称或非对称的样品，高对称性样品的电镜图像的取向和中心位置的确定过程中误差大大减少，就有更好机会获得更高分辨率三维结构。 本课题的实施旨在以高对称性的生物大分子复合体为研究对象，继续提高冷冻电镜高分辨结构解析的能力，并开展结构和功能相互关系的研究。 a. 获得一系列高对称 性生物大分子复合体的高分辨冷冻电镜结构，并 争取 独立构建 近原子级分辨率 模型 （ 1）以肠道病毒 71 型、重组人杯状病毒壳和重组 毒壳 等 为研究对象，开展对这些具有二十面体对称性的病毒壳的高分辨冷冻电镜结构的解析。这些都是重要的人类病毒，其中肠道病毒 71 型在婴幼儿中引发手足口病、神经系统疾病甚至死亡，人杯状病毒引起急性传染性腹泻，而 毒与中国南方高发的鼻烟癌紧密相关。（ 2） 以 狂犬病毒的核壳蛋白十聚体 等为研究对象 ，开展非二十面体的高对称性复合体的冷冻电镜三维结构解析。（ 3）以疱疹病毒 等 为研究对象，对高对称 性复合体的局部非高对称性结构（如疱疹病毒的 开冷冻电镜三维重构研究。当重构分辨率不足以建立原子模型的时候，参照同源蛋白和所获得的三维结构 密度图进行准原子模型的构建。 （ 4） 针对以上具有不同对称性的结构解析，探索 开发 高对称性 复合体 三维重构 的 新方法。如 针对较大尺度的高对称性大分子复合体的高分辨率结构研究；还希望 利用不同的对称匹配函数（ 如 二十面体、八面体、四面体及二面体对称匹配函数），对电镜数据进行拟合 ， 并充分利用生物大分子复合体的对称性，达到有效抑制噪声，最终提高分辨率的作用。 b. 构建具高对称性的 生物大分子 复合 体在 不同生理状态 或功能状态 下的高分辨 时空模型 利用冷冻电镜制样能够保持生物大分子生理状态下结构的特点，通过生物化学手段，对不同生理状态下的同一生物大分子进行分离，解析其在不同生理过程中的高分辨三维结构；观察蛋白结构域的变化，在分子或者氨基酸残基的水平上研究蛋白结构功能间的相互联系；并针对某些氨基酸残基加以突变，观察其三维结构变化，研究其在大分子功能中所起的作用。 本研究将以肠道病毒 71 型 等为研究对象，获得 在不同生理状态和 功能状态 的三维重构，并构建它们的高 时空 分辨率模型。 肠道病毒 71 型是在酸性的肠 道中开始其细胞感染过程的，但病毒致病和病理发生很多是在偏中性的神经细胞中进行的。因此需要了解不同生理环境下该病毒的结构变化以及病毒感染和病理发生的结构学基础。另外，目前对该病毒的中和性抗原位点在病毒壳上的定位以及抗体中和的机制尚不清楚。通过获取病毒在不同生理状态下以及和中和性单抗 复合体 的高时空分辨率 结构，就可以准确定位中和性抗原位点，揭示抗体中和的分子机制。这方面的研究将为制备广谱的中和性抗体和优化疫苗的设计提供坚实的实验依据和理论基础。 课题 四 , 病毒、亚细胞器和细胞的高时空分辨结构及其功能的在 体 /原位研究 冷冻电子断层成像方法是目前唯一一个能在纳米水平观察细胞内蛋白质的结构和相互作用的方法，填补了低分辨率的光学显微分析以及原子分辨率的 时，它在保持生物体活性和结构特征细节等方面具有独特的优势。 本课题的主要研究内容是 a. 冷冻电子断层成像的高通量数据收集以及电子断层图像的自动处理和高精度三维重构的方法研究 对于具有结构同一性的蛋白、病毒及其复合物等的三维重构，可采用课题一至三中的单颗粒重构方法进行结构解析。但对没有结构同一性的病毒及其复合物，以及细胞器和细胞水平下的蛋白质 相互作用的三维结构解析，只能采用电子断层成像方法通过获取同一区域的多个角度的投影图来反向重构它们的三维结构。 电子断层成像数据采集时倾转样品台，存在两个问题需要解决：第一，由于仪器样品台只能倾转到有限的角度 70，导致 （ 70的数据缺失，此即所谓 “数据失锥问题 “（ 第二，由于样品台倾转，导致样品不同区域相对于焦点具有不同的高度，因此受不同的衬度传递函数（ 制。目前常用的结构解析方法还没有很好地处理 这两个问题，限制了结构解析的分辨率。我们将在课题进行过程中对这两个问题进行深入的研究，采用双轴倾转等方法尽量克服“数据失锥问题”的影响，并对不同高度的区域进行衬度函数校正。 同时，我们将充分结合电子断层成像和单颗粒分析的各种优势，在用电子断层成像方法得到病毒、细胞器以及细胞切片等的三维结构后，对其中具有重要生物学意义的重复亚单元利用单颗粒分析类似的方法进行三维空间中的多颗粒平均以及分类，以得到这些亚单元的高精度三维结构。本部分可以和课题一的团队进行密切配合与交流。 此外，随着电子显微镜硬件设备的改进和电 子断层成像应用的越来越广泛，冷冻电子断层成像的全自动、高通量数据收集以及图像的自动处理和高效三维重构也有更为迫切的需求。因此，我们在课题进行过程中将努力探讨新的样品制备、数据采集、图像处理和三维重构方法，与课题一密切配合并积极采用课题一的最新研究成果。同时，我们将发展 据与电子断层数据整合算法，扩展数据范围，并提高结构解析的分辨率。 在以上电子断层的方法学的研究之上，我们将开展以下方面的应用工作： b. 心肌细胞内部及其 “钙火花 ”分子机器、肌细胞兴奋 位三维重构 心肌细胞上的钙信号转导是调控心肌细胞兴奋 其基本单元 “钙火花 ”的发放过程涉及到多种分子的相互作用，比如细胞表面质膜上有电压门控 浆网膜上有负责钙释放的离子通道 体 （ 子排列成二维分子阵列，形成钙释放单元 （ 质膜 成二联体。在心脏收缩期，由 十倍地放大钙信号，这一过程称之为 “钙致钙释放 ”。对于这样一个复杂的过程中涉及到的多种分 子的三维结构，特别是在心肌细胞中的这些分子与分子之间如何进行相互作用，目前所知甚少。本课题的研究将揭示这些分子机器对钙信号转导的作用机理及调控机制及其与生理活动和心力衰竭的关系，为心脏病的预防及治疗提供指导。 c. 利用冷冻电子断层成像方法研究 毒、 毒和禽流感病毒等包膜病毒的结构 包膜病毒对人体靶细胞的侵蚀都是通过病毒表面的包膜蛋白（ 位于靶细胞表面的受体结合而引发的。在针对这些病毒的疫苗开发中，如何诱发和白有效结合的中和抗体（ 需要解决的关键问题。这些包膜蛋白在真实病毒表面的分布和结构信息，它们和 细胞生理环境下如何相互作用，作用位点和方向如何，都所知甚少。本课题将利用冷冻电子断层三维重构方法研究 毒、 毒以及流感病毒等和靶细胞受体以及不同结合位点的中和抗体的在体 /原位相互作用。通过解析这些重要疾病相关的病毒 合体的高分辨三维结构来精确定位靶细胞受体以及不同的中和抗体在真实病毒表面的空间位置、作用位点及方向，分析病毒表面抗原的结构组成细节。 d. 利用冷冻电子 断层成像方法研究其它具有重要生物学意义的大分子及其复合物的三维结构 除了以上心肌细胞 “钙火花”分子机器以及包膜病毒表面结构等，我们还将利用冷冻电子断层成像方法研究其它具有重要生物学意义的生物大分子以及复合物的结构，如对表观遗传起重要作用的核小体 色质的高级结构及其调控的结构机制等。 e. 开展心肌细胞钙释放以及病毒 结合定点突变等生化手段和快速冷冻的方法 ， 我们可以将心肌细胞钙释放以及病毒 程的不同时间阶段（如心肌细胞钙释放的不同时间段、病毒 毒在细胞内的组装、成熟以及出芽阶段等）分别制样并进行冷冻电镜断层成像。基于课题一中的方法学工作，特别是最大似然法等非监督性分类方法，对获取的不同时间段的样品数据以及同一时间段内可能包含的不同构象的样品数据进行三维重构和分类 ， 由此获得心肌细胞的钙释放过程和病毒与靶细胞的结合过程在不同时间段的动态形态。通过对这些动态变化过程的可视化研究，开展对钙释放过程以及病毒 二、预期目标 总体目标 冷冻电镜结构生物学是当今国际生命科学领域的重点和热点之一 。 本项目将致力于探索相关生命过程中的重大科学问题，培养一批冷冻电镜结构生物学人才，推动中国冷冻电镜结构生物学研究进入世界领先水平。我们的总体目标是集中力量开发全自动化、高通量的冷冻电子显微学方法，并在此基础上开展对重要生物大分子复合体（如核糖体、膜蛋白、病毒等）的高时空分辨的功能态结构的解析， 同时开展基于电子断层成像方法的在细胞和亚细胞水平上的实时在体研究。 五年预期目标 1. 建立一流的冷冻电子显微学技术平台，开发全自动化、高通量冷冻电镜数据采集系统、 高性能并行化的图像处理和三维重构方法，以及解决结构不均一性的电镜数据分类方法。 2. 利用单颗粒重构方法，解析若干个与重要生命活动及重大疾病相关的生物大分子复合体的高分辨的功能态结构，包括原核和真核细胞各功能态下的核糖体， 膜转运复合体等膜蛋白相关复合物，具 有 二十面体对称性的病毒壳（如肠道病毒 71型，重组人杯状病毒壳等），非二十面体对称性的病毒蛋白复合体（如水庖性口炎病毒的核壳蛋白多聚体等），以及 具有局部低对称 性病毒等。 3. 利用电子断层成像方法利用电子断层成像方法，进行正常的细 胞生理环境下蛋白 毒 及病毒 建一些与重要生命现象或重大疾病相关的生命过程的高精度三维结构模型。解析心肌细胞 “钙火花”分子机器、包膜病毒表面分子及其复合物、以及核小体 4. 在冷冻电镜结构生物学领域培养一支高水平科研队伍。培养一批优秀的硕士研究生，博士研究生和博士后研究人员。 5. 研究成果主要以研究论文形式公布，拟在一流国际刊物上发表学术论文 30篇以上。 三、研究方案 1、总体思路 本课题的中心学术 思想是依据国家 2006蛋白质研究 ”重大计划，集中力量发展冷冻电子显微学这一具有高度潜力的结构生物学新技术和新方法。对一系列重要的生物大分子复合体的结构和功能展开研究，力争获取它们在各功能状态下的冷冻电镜高 时空 分辨结构，进而阐明这些重要生物大分子复合体的结构与功能的关系。本项目课题 1 致力于突破高分辨冷冻电镜结构解析的限制因素，积极展开方法学领域的研究，开发全自动化、高通量冷冻电镜数据采集和三维重构图像处理方法。在课题 1 的基础上，课题 2将利用单颗粒三维重构方法解析若 干个与重要生命过程相关的低对称或非对称性的生物大分子复合体（包括细胞内可溶的大分子复合体，以及一些重要膜蛋白或者与膜相关联的蛋白）的高分辨结构，尤其是与它们的动态过程直接联系的各种功能态的结构，并同时开展相关的生理功能性的研究；课题 3 致力于解析一系列重要的高对称性病毒大分子的准原子分辨率结构（ 3并独立构建分子模型，进而揭示这些病毒大分子的动态结构变化和功能的关系。课题 4 将利用冷冻电子断层成像方法，重构一系列病毒、亚细胞器和细胞的三维结构，开展重要的在体 /原位研究 工作。课题 1 重点是理论方法上的研究和 突破，它的研究成果将为课题 2供方法基础；课题 2在分子层次上研究；课题 4 是细胞和亚细胞层次上的研究。这四个 课题既相互关联，又相互独立。 参与本项目的清华大学、中科院上海巴斯德研究所、中科院生物物理所、以及北京大学是我国冷冻电镜结构生物学的研究中心。我们将发挥各自优势，重点突破，共同协作，促进我国冷冻电镜结构生物学的进步，尽快使我国的结构生物学研究达到世界领先水平，并培养出一批冷冻电镜结构生物学的杰出人才。 2、技术途径 1) 本项目采取多学科相互交叉、渗透和有机结合的途径，以冷冻电子显微学为主，结合 应 用数学、物理学、化学、信息科学、计算机科学等，开发全自动、高通量冷冻电子显微学方法； 2) 本项目采用理论研究与实验科学相结合的策略，理论研究（课题 1）的成果指导实验科学（课题 2实验科学中遇到的问题反过来推动理论研究，两者互相促进； 3) 本项目采用一般性与特殊性相结合的策略，既保证课题的相对独立，又保证课题的相互协调。对于所有课题都存在的一般性问题，如样品的冷冻制备和数据采集问题，所有课题同时进行，一旦有一个课题组成功，其它课题组可借鉴成功的经验，加快课题的进度；而对课题专一的特殊性问题，如图像处理问题和结构 解析问题，则分别进行，各个击破； 4) 本项目课题由分子层次到细胞与组织层次，由简单到复杂，循序渐进，确保项目成功； 5) 离体（ in 在体（ in 究相结合。一方面在分子水平离体研究生物大分子复合体的结构（课题 2另一方面应用电子断层方法在体研究生物大分子复合体在细胞内部的结构及相互作用（课题 4），使离体与在体研究相统一。 四、年度计划 年度