通过单克隆抗体技术处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定.ppt

使用单克隆抗体技术处理加热的肌肉蛋白质以识别肉的类型并确定加热的肉的终点温度，陈芳华和纽约大学食品科学与营养系的AuburnAlabana36849引起了消费者和监管机构的广泛关注。酶联免疫吸附试验(ELISA)被认为是一种非常有效和合适的检测和分析方法，用于生肉产品的质量控制，加强食品安全和分类管理。为了定量检测加热产品中的各种混合肉，许多单克隆抗体被逐步开发并应用于酶联免疫吸附技术。单克隆抗体技术是在作用于热处理过的肌肉蛋白的过程中发展起来的。随着加热终点温度的升高，酶联免疫吸附反应的程度也增加。MABS可用于检测肉类中的特定肉类类型。因此，MABS可以用来确定预煮肉的最高内部加热温度，以确保产品的安全性。本部分主要介绍了MABS目前的技术和实验操作流程、特点和应用。简介：由于经济损失、食物过敏和宗教信仰，肉中掺入不明肉类在很大程度上欺骗了消费者。联邦法律要求肉类产品贴上标签，以证明其含有的肉类种类。许多国家都有肉类替代的报道，例如，在英国，马肉被用作牛肉和羊肉。马肉和袋鼠肉是加拿大出口的牛肉。猪肉被用作出口到中东的牛肉和羊肉。随着机械去骨去肉在食品企业中的应用越来越多，人们近来越来越关注各种加工过程和预煮、肉和肉制品。美国农业部的食品安全和检验服务(美国农业部-FSIS)条例规定，机械切割肉类的使用如下：只使用一种肉类的肉类产品不需要包含任何其他类型的机械切割。然而，由于不正当交易和国家经济欺诈的存在，在国内零售市场上将未知的杂肉混入鱼和陆生动物肉制品中已经成为一种普遍现象。研究表明，熟食比生产品掺假率高。向产品中添加各种未知肉类也是一种非常普遍的现象。肉类应烹调足够长的时间，以促进人体消化和吸收，并确保消除致病微生物。食用新鲜肉类和家禽产品时烹调不当被认为是传染病的主要原因。美国农业部-FSIS特别规定了肉制品加热过程的指导方针，每种肉应该有多种预煮产品。例如，未干燥的家禽产品的中心温度必须加热到71.1，而干燥的家禽产品也必须加热到68.3以杀死沙门氏菌。为了保证大肠杆菌O157的消除，烤牛肉的酸碱度应控制在7和68.3左右。其他产品的酸碱度为7，加热温度为71.7。新鲜猪肉加热时，内部温度应达到76.7，杀灭旋毛虫的温度应至少比这个温度高17。然而，一旦肉与其他未知肉混合，特定类型肉的最低内部加热温度将由于未知肉的存在而无效。为了防止肉类掺假，减少加热过程不充分引起的食源性疾病的危害，管理和监督部门采用可靠的分析方法来实施肉类管理程序是非常必要的。最理想的方法具有特异性、敏感性、快速性、经济性和检测率高的特点，并能提供定量结果。虽然单一的方法可能不能满足每种条件下的所有要求，但选择用于肉类检测的酶联免疫吸附法可以满足大多数要求。多克隆抗体(PABS)和单克隆抗体(MABS)都已用于酶联免疫吸附试验。MABS比PABS有更多的优势：持续使用、稳定的特性和与免疫试剂的相似性。在免疫分析中使用MABS可以提供独特的试剂并降低分析成本。MABS已被用于生肉品种的鉴定。因为在正常情况下作用于蛋白质的抗体在大多数情况下不能识别加热肉中的蛋白质，所以MABS被用于实验室来检测加热肉中掺杂的肉的类型。MABS可以定量检测所有热处理肉混合物中目标品种的含量，并可以确定预煮肉的最高集中加热温度。我们主要讨论MABS实验操作过程的特点及其应用。在本章中，我们还对这两个领域中的现有方法进行了总体评价。2掺假肉类种类的确认2.1非免疫方法。在过去的20年里，许多用于确认肉类种类的非免疫方法，如电泳和色谱，已经得到了极大的发展。蛋白质的分离电泳技术非常有效。不同肌肉蛋白质的SDS-PAGE通常产生相同的蛋白质类型，因此其在肉类类型确认中的可信度很小。等吸附技术可以根据蛋白质的不同等电点，将蛋白质按不同类型进行分离。这项技术被广泛用于确认鱼的种类，也可用于区分不同种类的生肉。然而，当混合肉中含有多种肉类或蛋白质添加剂时，很难解释检测结果。诸如气相色谱、液相色谱和高精度色谱之类的色谱已被广泛用于确认肉类类型。该方法基于对肉类样品中脂肪酸组成、族氨基酸或蛋白质形状的检测。这些方法可以区分不同个体的肉的类型，但是由于色谱类型的复杂性增加，这些方法将不能检测复合肉中混合肉的类型。随着分子生物学技术的迅速发展，包括DNA杂交、聚合酶链反应和片段分析，法医学以及食品科学发生了革命性的变化。DNA杂交技术已被用于多介质肉类品种的鉴定。下一步，基因组DNA或克隆的DNA将与目标DNA杂交，并使用彩色或自X射线照相技术进行检测。这些方法是独特的，在确认熟肉制品品种时非常有用，但在确认密切相关的肉类时效果不佳。下一步是准备在基因组DNA水平上展示牛、羊、山羊和野生动物的交叉反应。交叉反应可以通过混合未标记的DNA修饰的DNA杂交来减少，因此绵羊和山羊可以与交叉杂交物种区分开来，其差异极限约为10%。绵羊肉和山羊肉的区别是通过使用直接连续技术比较核苷酸序列来实现的。同时，对限制性内切酶聚合酶链反应的产物也进行了分析。由于操作的高成本和复杂性，这些基于DNA水平的技术没有被常规分析方法所采用。2.2免疫学方法，免疫学方法是基于特异性抗体-抗原反应，它适用于分析复杂混合物中的成分，并且这种成分具有最低的检测量。从本世纪开始，免疫技术已被用于确认动物肉类品种。免疫技术的优点是可以大大提高检测的灵敏度和结果的准确性。沉淀环实验是一种简单的免疫分析方法。其原理是在实验管中抗血清和肉抗原的汇合处可以产生可见的环。血凝抑制试验是基于防止抗原血清与其相似抗原之间的阳性反应，该抗原被同一只外来绵羊的红细胞包裹。琼脂胶体免疫扩散，双层免疫扩散技术起源于Oucheyriony(1948)，也涉及抗血清和抗原在半固体琼脂胶体中的扩散。过夜培养后，在抗体及其相应抗原的汇合处形成可见的不透明带。美国农业部-FSIS肉类检查员对这项技术进行了一些改进，使用事先准备好的校准试剂纸和琼脂平板，使这项技术在检测生肉类型时更加方便。琼脂凝胶免疫扩散实验的灵敏度易改变，培养时间长，非肉类成分干扰大，限制了其在全鲜肉分析中的应用。免疫分析常用于临床治疗，但一项研究指出，牛肉中5%的其他成分是通过免疫试剂检测出来的。由于放射免疫分析使用有害的放射性物质和闪烁计数器，其在日常检验和肉类检测中的应用受到限制。酶联免疫吸附法因其不需要太昂贵的科学仪器、操作简单、免疫试剂用量少、可应用于大批量、大范围的检测等优点，已被广泛应用于肉类种类的确认。三种间接酶联免疫吸附试验竞争，酶联免疫吸附试验和夹心酶联免疫吸附试验是常用的。间接酶联免疫吸附法，它先将抗原吸入微孔板，然后将对面动物的抗体与抗原结合并吸附在固体层上，通过两者的结合与后来加入的抗免疫球蛋白结合，从外面加入酶形成颜色。它可以检测抗原和抗体的结合。竞争酶联免疫吸附技术基于从样品中提取有限的抗体和抗体，而游离抗原和与固体结合的抗原与抗体竞争。固相抗原结合的特异性抗原的极限数量与液相中抗原的数量成正比。夹心酶联免疫吸附试验使用固相抗体作为结合抗体。另一种抗体用作检测抗体。因此，这形成了一个夹心，抗原在中间，抗体在抗原分子的两侧。表1总结了对于不同类型的酶联免疫吸附试验，用各种肉的抗原对生肉的确认。最近，单克隆抗体技术也被应用于酶联免疫吸附试验(ELISA)中，以确定生肉，酶联免疫吸附试验(ELISA)也被用于确定熟肉的类型。2.3、抗体的来源，在使用酶免疫测定法来确认成功开发肉类种类的过程中，最重要的是特定种类的抗体，不同种类的动物需要不同的免疫试剂。传统上，用于酶联免疫吸附试验的单克隆抗体来自免疫动物的血清。多克隆抗体技术本质上是外源性的。子集与特定类型的抗原或相反类型的抗原结合。因此，很容易观察到血清和相关抗原之间的交叉反应。在检测水平标准化的发展过程中，一组抗体的亲和力和结合力也引起了人们的关注。与多克隆抗体技术相反，单克隆抗体技术的来源单细胞链在本质上是同源的。它们来自融化的抗体分泌物淋巴细胞，而淋巴细胞又来自患有骨髓瘤的免疫小鼠。融化的产物被称为杂交细胞，它可以在培养基中生长，并能持续分泌抗体。经过仔细的显微镜检查和亚克隆，可以选择稳定的杂交细胞链，它可以分泌针对特定抗原的抗体，并非常频繁地产生抗体。应采用单抗体法对肉类进行免疫分析。应确保持续供应统一的免疫试剂，并减少标准分析程序。在选择2.4抗原时，大多数生肉物种的免疫检测方法采用多克隆方法来处理整个血清或血清蛋白。因为血清蛋白的存在可能是必需的，并且肌肉组织中残留的血浆成分将会改变，这意味着肌肉组织的存在，然后可以得出结论，通过这些多克隆技术定量估计掺杂物的量是不可靠的。肌肉蛋白的存在是显著的，这表明鸡组织的可能性大于血清蛋白。肉类物种的多克隆技术已被用于可溶性粗蛋白的分析或肌钙蛋白和肌红蛋白等肌肉成分的纯化。这些检测方法的优点在于容易获得提取的样品，更重要的是改进和发展了传统的检测方法。不溶性肌肉蛋白如连接蛋白也可用于单克隆抗体分析方法，以确定生禽肉的类型。然而，不溶性蛋白质的提取需要特殊的步骤。毫无疑问，这些方法可以应用于法律事件的检测，但它们不适用于常规检查分析或原产地检查。因为大多数蛋白质在热处理后变性并变得不可溶，所以用抗体处理天然蛋白质的方法不能用于热处理过的肉。热稳定蛋白也用于加热肉的确认。已经做出了很大努力来解决特定类型的热稳定性组合物。通过IEF方法，琼斯和莫蒂纳(1985)证明了来自肾上腺和肌肉组织的BE抗原蛋白具有热稳定性。然而，不同类型的贝氏体抗原的特征明显不同。谢里卡尔用聚丙烯酰胺凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测了不同类型的肌钙蛋白抗原，并得出结论肌钙蛋白属于不同类型的蛋白。不经热处理从肌肉组织中分离的具有耐热性的糖蛋白应用于多克隆抗体技术。这些抗体已用于夹心酶联免疫吸附试验，以鉴别加热和罐装肉类。这些方法在商业测试中非常有效，也适用于美国农业部对加热肉类类型确认的调查。多克隆抗体技术主要用于确定加热肉的类型。近年来，我们实验室利用单克隆抗体技术对加热肉类进行类型鉴定的研究取得了一些进展。用于热处理肉蛋白质鉴定的单克隆抗体技术也可以用于生肉的鉴定，因为这些生肉在制备测试样品时可以容易地进行热处理。3、用于确认肌肉蛋白质热处理的单克隆抗体技术3.1单克隆抗体的引入，用于热稳定性或耐热性蛋白质的不同抗原已用于开发抗体技术以确认加热肉制品的类型。热稳定性一词在词典中有明确的定义。在大多数情况下，它指的是热处理后在肉提取物中保持可溶性和抗原性的完整蛋白质或蛋白质片段。如果已知特定的分析蛋白可用于特定物种的鉴定，则在免疫测定技术中使用纯化蛋白可增加对特定抗原决定簇物种的免疫反应机会。然而，没有必要纯化蛋白作为杂交瘤分泌物的抗原。由于缺乏足够的知识和技术来选择合适的特定类型的蛋白质，我们在单克隆抗体技术中使用加热的可溶性粗肌肉蛋白作为免疫源。加热后，纯肉蛋白质显著减少，因此只有提取物中蛋白质的热稳定或耐热部分保持可溶。当应用MABS(单克隆抗体技术)检测所需特征时，应选择杂交的克隆分泌物，并且必须进行仔细的显微镜检查和亚克隆。制备抗原有两种方法：用蒸馏水或盐水搅拌粗瘦肉，过滤器可用作免疫原。2)将瘦肉混合在0.15毫升氯化钠中，用沸水加热并离心。将上清液在121下灭菌过滤30分钟，用90%乙醇提取，沉淀，将干物质溶解在盐溶液中备用。来自免疫小鼠的脾细胞在与骨髓瘤细胞融合后可用作杂交产物。在我们的实验室中，遵循科勒和米尔斯特恩描述的一般程序，即在后续步骤中进行必要的修改。酶联免疫显微镜检查用于通过实验选择与抗原相对应的克隆，同时通过异质提取物和其它食物蛋白之间的交叉反应来稳定杂交体。杂交产物具有所需的特性，然后通过有限的稀释程序克隆至少两次，以获得稳定的单克隆细胞链。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫斑点技术对每种单克隆肉提取物的抗原成分进行了鉴定。3.2单克隆抗体的特性。迄今为止，已有五种免疫球蛋白单克隆抗体技术用于检测掺假肉类。单克隆抗体2F8与五种加热的哺乳动物肉反应强烈，但与任何加热的禽肉不反应。3E12与禽肉反应，5D2主要用于鉴别鸡和火鸡。9C6是鸡特有的，5H9是猪肉特有的。第一组四种单克隆抗体技术用于水或盐水浸提的热处理肌肉蛋白。它们与生肉反应强烈，但不同的生肉和热处理过的肉相互作用。蛋白质印迹结果显示，除5H9外，所有单克隆抗体均与热处理肉提取物中的两条或多条蛋白带发生反应，但在猪肉提取物中仅检测到一条蛋白带。5H9还与生猪肉提取物的三条蛋白带发生反应，具有24KD的蛋白可被确认为猪肉的特异性热稳定肌肉蛋白。所有单克隆抗体也对骨骼肌产生了特异性反应。表3说明了5H9对不同猪肉组织和食物蛋白的免疫反应，也说明了5D2的特征反应。这些单克隆抗体具有不同于其他报道的