第七章 生产菌种的扩大培养与保藏.ppt

第七章生产菌种的扩大培养和保存，第一节种子扩大培养的概要，种子扩大培养是指将在砂土管、冷冻干燥管中保存的处于休眠状态的生产菌种放入试管斜面活化后，逐步扩大培养瓶、瓶和种子罐，获得一定数量和品质的纯种的过程。 发酵工业生产过程中种子必须满足以下条件： (1)菌种细胞生长活力强，移植到发酵槽后快速生长，延迟时间短；(2)生理状况稳定，个体和集团满足相同的生长要求；(3)菌体总量和浓度可以满足大容量发酵槽的要求种子扩培的目的：接种量需求，种菌驯化，缩短发酵时间，保证生产水平，工业微生物种菌培养的类型：工业微生物培养法可分为静置培养和通气培养两种。 静置培养法是将培养基放入发酵容器中，接种后不通过空气使其发酵，也称为厌氧发酵。 通气培养法生产菌种多为好氧菌和兼性好氧菌，其生长环境为保持一定的溶解氧水平供给空气，使菌体迅速生长发酵，又称为好氧发酵。 静置和通气培养两种方法有液体培养和固体培养两种，其中分别有表面培养和深层培养的区别。 主要培养方法和特征：(1)表面培养法包括茄子瓶、克瓶或瓷器皿培养。 (2)固体培养法包括三角瓶、蘑菇瓶、克瓶、培养皿等面筋培养。 (3)液体培养法包括液体试管、三角瓶的床振动和旋转式培养。 小瓶通气量的大小与小瓶机型式、转速、振动范围(或偏心距离)、三角小瓶容量、充气量有关。 (4)载体培养法以天然或人工合成的多孔材料代替麸质等固体基质作为微生物的载体。 (1)表面培养、表面培养通过好氧静置培养方法，将容器内培养基的状态分为液体表面培养和固体表面培养. 相对于容器内的培养基体积，表面积越大，越容易促进氧从气体液(气固)界面向培养基内的传递，包括茄子瓶、克瓶、瓷器盘的培养。 该培养方法的菌的生长速度与培养基的深度有关，每单位体积的表面积越大，生长速度也越快。 氧气的供给多是发酵的限速因素，所以发酵周期长，占地面积大。 具有不需要深层培养时的搅拌和通气，可以节约动力的优点。 醋酸，柠檬酸发酵，曲盘制曲等。 固体培养分为浅盘固体培养和深层固体培养，曲法培养总称。 它来源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。 其最大的特征是固体曲的酶活性高。 (2)固体培养、固体培养原料：以谷物和农业废弃物为主要原料，加入适量的水分、无机盐等即可。 培养基的组成很简单。 防止污染：利用霉菌能在水分低的基质表面增殖的特性时，由于细菌生长不良，不易引起细菌污染。 通气：无论浅盘或深层固体通风制曲，曲房周围都可以使用循环冷却加湿的无菌空气控制温湿度，并且可根据菌种的生理时期灵活调节。 在固体培养中，氧从基质粒子间的空隙的空气直接供给微生物，比液体培养时的通气搅拌供给氧更节能。 缺点是劳动强度大，(3)液体深层培养，液体深层发酵槽从罐底部通气，输送的空气通过搅拌叶片分散到微小气泡中促进氧的溶解。 这个罐底部通过通气搅拌的培养方法，相对于从气液界面通过自然扩散溶解氧的表面培养法，被称为深层培养法。 其特征是，根据生产菌种对代谢的营养要求和不同生理时期的通气、搅拌、温度、培养基中的氢离子浓度等条件，容易选择最佳培养条件。深层培养基本操作的三个控制点：灭菌：发酵工业要求纯培养，发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。 因此，烘箱包括用于对培养基和烘箱进行加热灭菌的蒸汽套，或者用连续加热灭菌器对培养基进行灭菌，并连续地输送到烘箱内。 温度控制：将培养基灭菌后，冷却到培养温度使其发酵，随着微生物的繁殖和发酵而发热，搅拌发热，为了使温度维持一定，使冷却水在套管中循环流动。 通气、搅拌：空气进入烘烤罐前，用空气过滤器去除杂菌，变成无菌空气，从罐底部进入，通过搅拌使空气分散成微小的气泡。 为了延长气泡的滞留时间，可以在罐内放入挡板来产生漩涡。 搅拌的目的除了溶解氧之外，还能使培养液中的微生物均匀地分散在发酵槽内，促进热传递，使为了调节pH而添加的酸和碱均匀地分散。 几种深层培养法，扩增法二阶段法培养法分批发酵法(间歇发酵法)连续培养法补充分批培养法(流加)，扩增法，将微生物在摇瓶的基础上逐步放大实现大规模生产。 厌氧发酵中出现的问题是从大型发酵槽中去除发酵热的方法。 去除发酵热的方法主要是利用冷却水的方法，另外也可以考虑如何利用发酵时产生的二氧化碳引起的液体的流动和搅拌来提高冷却效率。 在好氧培养中，多以氧气的供给为基准放大。 一般从实验室的规模到工厂的生产经过3-5个阶段的扩大工序。 在扩大过程中，必须考虑a .氧传递速度相等。 b .比较不同阶段搅拌叶片前端速度。 c .比较不同阶段每单位液量所需的搅拌动力。 d .混合时间是一样的。 e .雷诺的基准数相同。 f .通过反馈控制尽可能使重要的环境因子一致。 两步法、酶制剂生产和氨基酸生产酶制剂生产两步法的特点是区分菌体生长条件(营养期)和产酶条件(自我繁殖期)。 菌种首先在丰富的培养基中大量繁殖，收集菌体浓缩物，清洗后，转移到添加了衍生物的酶产生培养基中，在此期间，菌体中会积蓄大量的酶，不再普遍繁殖，可以充分利用营养成分和衍生物。 在氨基酸的两阶段液体深层培养中，每一阶段菌种和培养基都不同。 第一阶段是有机酸发酵或氨基酸发酵。 第二阶段，利用微生物产生的酶，将第一阶段的产物转换为所希望的氨基酸的生产方法也被称为酶转换法。 两阶段的技术虽然复杂，但仍有实用价值。 控制培养方法，掌握发酵罐内部的变化情况，掌握短时间内状态变量的变化和可测定的环境因子对微生物代谢活动的影响，在此基础上控制培养，达到产物的最佳培养条件。 另外，用测定状态变量的传感器取得数据，用计算机综合分析，将其结果作为反馈调整的信号，将环境(培养条件)控制在规定的基准内。 这被称为电子计算机控制发酵。 目前大量用于露天大罐啤酒发酵。 分批发酵法(分批发酵法)，首先将空罐杀菌，将培养基放入发酵槽，接种培养，培养中培养基成分减少，微生物增殖。 微生物周围的环境随时间变化，是一种非稳定的操作方法。 该方法不易感染，但用控制基质浓度的方法很难提高发酵生产能力。 目前常用于酒精、氨基酸和抗生素的生产。 连续培养法是在向发酵槽连续供给新鲜培养基的同时，从发酵槽连续放出含有微生物和产物的培养液的连续培养法。 其特征是能将微生物放在一定的环境中长期持续培养，因此该系统的稳定性被称为稳定器。 同时包括流入和流出，为开放系统，变异株和杂菌污染随时间的推移而增大。技术上也很难保证流入和流出速度一致。 连续培养用于废水处理、葡萄糖酸发酵、酒精发酵等工业。 补充材料分批培养法(流加)，在分批培养的时候，不断地供给培养基，但是不在一定的时间放出必要的产物的方法称为补充材料分批培养法。 用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工业。 (4)载体培养、载体培养源于曲霉法培养，同时吸收液体培养的优点，是近年来新发展的培养方法。 以天然或人工合成的多孔材料代替面筋之类的固体基质作为微生物的载体为特征，它可以严格控制营养成分，发酵结束后，只要挤出菌体和培养液来提取，载体就可以再利用。 载体的采访必须经得起蒸汽加热和药物灭菌，多孔结构具有充分的表面积，还可以允许空气流通。 第二节种子的制造过程、种子的制造过程大致分为两个阶段： (1)实验室种子的制造阶段、(2)生产现场种子的制造阶段、一、实验室种子的制造、(一)孢子的制造1 .细菌芽孢的制造细菌的斜面培养基多采用碳源有限、氮源丰富的处方。 培养温度一般为37。 不产生芽胞的细菌培养时间一般为12天，产生芽胞的细菌培养时间为510天。 2 .制备霉菌孢子一般以米、米、玉米、麸质、麦粒等天然农产品为培养基，培养温度为2528，培养时间为414天。 3 .放线菌孢子的放线菌孢子培养采用琼脂斜面培养基，培养基中含有适合孢子产的营养成分，如面筋、豌豆浸汁、胨和无机盐等，培养温度为28，培养时间为514天。 (二)制作液体种子孢子产能力不强或孢子发芽慢的菌种1 .灰色链霉、霉菌好氧培养过程，试管斜面三角瓶摇床种子罐，2 .厌氧培养酵母菌(啤酒、酒、清酒等)的种子制造过程，试管三角生产现场种子的制造，1 .决定种子罐的作用2 .种子罐的级数：指生产种子需要逐步扩大培养的次数。 (1)取决于菌种的生长特性、孢子发芽和菌体繁殖速度。 (2)采用烘箱的容积。 例如细菌：二级发酵，茄子瓶种子罐发酵槽霉菌：三级发酵孢子悬浊液一级种子罐(27，40h孢子发芽，产生菌丝)二级种子罐(27，1024h，菌体快速繁殖，粗菌丝体)发酵槽放线菌：一级种子，3 .种子塔(2)种子级数少，接种量少，发酵时间长，降低发酵罐的生产效率，增加染色机会。 (3)种子罐的级数取决于生产物的品种和生产规模，与选择的工艺条件也有关系。 第三节种子质量的控制，第一，影响孢子质量的因素和控制1 .培养基的解决办法： (1)使用的原料如果不通过发酵试验就不能使用；(2)严格控制灭菌后的培养基质量；(3)在使用斜面培养基前，在适当的温度下放置一定时间；(4)生产用的胞2、培养条件(1)温度一般各生产部门严格控制孢子斜面的培养温度。 (2)湿度孢子容易在干燥条件下形成。 3 .培养时间和冷藏时间(1)培养时间的解决方法：孢子培养时间孢子量大，孢子成熟时应停止培养。 (2)冷藏时间斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟度有关的冷藏时间还影响孢子的生产能力，4 .接种量影响培养基中孢子的数量，还影响菌体的生理状况。二、影响种子质量的因素和控制，一.培养基种子培养基应满足以下要求： (1)营养成分适合种子培养，(2)选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基，(3)在营养上容易被菌体直接吸收利用，(4)营养成分适当丰富且完全氮源和维生素含量高，(5)营养成分尽可能接近发酵培养基；2 .培养条件(1)温度(2)通气量充分，能提高种子质量；3 .种龄：种子箱培养的菌丝体开始移动到下一段种子箱或发酵箱时的培养时间。 例如，嗜碱性芽胞杆菌产生碱性蛋白酶，4 .接种量接种量：移入的种子液的体积与接种后培养液的体积的比例。 接种量的大小取决于生产菌种在发酵槽繁殖的速度。 一般采用大的接种量，通常接种量为细菌15%、酵母菌510%、霉菌715%，有时为2025%。 三、种子质量控制措施、种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中的生产能力。 1 .菌种稳定性的检查2 .无杂菌检查，四，种子质量标准，1 .细胞或菌体菌丝形态，菌丝浓度和培养液的外观(色素、颗粒等)单细胞：菌体结实，菌形均匀，整齐，有时要求一定的序列和形态，霉，放线菌：菌丝粗，对某种染料着色力强2、生化指标种子液糖、氮、磷的含量和pH值的变化3 .生成物的生成量在抗生素发酵中，生成物的生成量是考察种子质量的重要指标。 因为种子液中生成物的生成量的多寡间接反映种子的生产能力和成熟度。 4、酶活力种子液中某些酶的活力与目标物的产量有一定的关系。 五、种子异常分析，菌种的生长速度，过快或过慢的菌丝结菌丝粘壁，第四节的例子一，谷氨酸发酵的菌种扩大培养斜面菌种一次种子培养二次种子培养发酵槽1 .斜面菌种的培养(1)斜面培养基组成葡萄糖0.1%，蛋白陈1.0%，牛肉糊1.0%，氯化钠琼脂2.02.5%、pH7.07.2 (不在传代和保存斜面上添加葡萄糖) (2)培养条件3334、培养1824h， 2 .一次种子培养(1)培养基组成葡萄糖2.5%、尿素0.5%、硫酸镁0.04%、磷酸氢二钾0.1%、玉米淀粉2.53.5% (质量增减)、硫酸亚铁、硫酸锰各2ppm、pH7.0(2)培养条件频率96次/分钟，振荡培养12 一级种子质量要求种龄： 12hpH值：6.40.1光密度：净增OD值0.5%以上残糖：0.5%以下无菌检查： (-)噬菌体检查： (-)镜检查：菌体生长均匀且粗，排列克阳性反应，3 .二级种子培养(1)培养基组成：(2)培养条件接种量：0. 8 250L种子箱搅拌转速300r/min； 500L种子箱搅拌转速230r/min。 (3)二级种子质量要求种类年龄：78hpH:7.2左右的OD值净增加： 0.5左右的无菌检查： (-)噬菌体检查： -、二、啤酒酵母的扩大培养、1 .实验室的扩大培养、2 .工厂的扩大培养、第五节生产发酵槽的无菌接种、1 .实验室的横瓶或孢子悬浊液2 .从种子罐接种，第六节菌种的保存和复活，菌种的保存1 .菌种保存的意义2 .菌种保存的原理菌种的保存主要根据菌种的生理生化特征人工地创造条件，尽量降低孢子和菌体的生长代谢活动，减少其变异。 一般将培养基的营养成分保持在最低水平的缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体睡”状态，可以抑制繁殖能力。3、菌种的保存方法(1)斜面低温保存法(2)石蜡油保存法(3)泥沙管保存法(4)冷冻干燥法(5)超低温保存法，二、发酵工业微生物菌种的衰退和复活，(1)微生物菌种衰退菌种的退化菌种的退化，通常在长期保存后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐常见菌种衰退： (1)形态分生孢子减少，或菌落颜色变化。 (2)生理上菌种的发酵能力下降，部分菌种的抗噬菌体能力下降。 菌种的真正退化要区分环境原因变化引起的菌种形态和生