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文档简介

.,1,PCR扩增技术,.,2,一实验目的及背景,多聚酶链式反应(polymerasechainreaction)简称技术，是年代中期发展起来的一种体外扩增特异片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的序列的拷贝，技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。技术实际上是在模板，引物和种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促合反应，技术的特异性取决于引物和模板结合的特异性。反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（extension），反应过程见图。,.,3,模板在条件下变性形成单链；在条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；下在耐热性聚合酶Taq酶催化下，在种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标都以n次幂扩增，次循环后目的DNA的量增加倍。成功的反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。要达此目的反应要注意以下问题：,.,4,模板：反应中量在ngng左右。且纯度较高，以增加反应特异性。dNTP:反应体系中达100M200M。Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；含量在4070之间；引物内部不能有回文序列；引物端不能互补。,.,5,Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性聚合酶，在时分钟还有活力。变性温度：在之间使模板充分变性。复性温度：左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。延伸温度：左右，为Taq酶最适反应温度。,.,6,buffer:500mMKCl100mMTris-HCl(pH9.0)0.1%明胶1%TritonX-100MgCl22.5mMdNTP:1mM引物：actin上，actin下模板：20ng/lTaq酶：5u/lPCR仪，凝胶成像系统，电泳系统,二实验试剂及仪器,.,7,PCR仪凝胶成像系统,.,8,三.实验方法,向无菌的200lEppendorf管中依次加入以下溶液反应物体积10buffer2.5l*512.54dNTP(1mM)2.5l*512.5无菌水18l*590Taq酶(1U/ul)0.5l*52.5混合，吸取24.5l引物上0.5l*52.5引物下0.5l*52.5模板(20ng)0.5l总体积25l,.,9,反应体系混匀，离心在仪上按以下方式循环4变性5分钟4变性45秒30个循环55退火45秒72延伸1分钟延伸反应10分钟。取5l反应液加4lLoadingbuffer在.琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。在凝胶成像系统上观察记录实验
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