体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证ppt课件

体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析的样品处理和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,1.为什么要对生物样品进行处理？2.有哪些生物样品？3.有哪些样品处理方法？各自的特点。4.如何对分析方法进行验证？5.有哪些参考标准？,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,生物样品进行前处理的目的在于：1药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物。,一、处理的目的,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,2生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物，也含有Na、K、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此，为了保护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可靠性，必须对样品进行前处理。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,60%以上精力和花费用在样品前处理上,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。,二、生物样品的种类,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,全血不易保存，且血细胞中含有更多的干扰物质，影响测定，故很少采用全血测定药物浓度。仅适用于血浆药物浓度太低或者血浆药物浓度波动大，且难以控制的药物如：环孢霉素A。,1全血,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,测定血中药物浓度通常是指测定血浆或血清中的药物浓度，而不是指含有血细胞的全血中的药物浓度。将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、EDTA）的试管中，混合后，3000至4000r/min离心，分离血细胞，上清液即为血浆。,2血浆,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,血浆中含有的物质种类和比例,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置15-30min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白，更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常是相同的。,3血清,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作为作用部位药物浓度的可靠指标。血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20的条件，长期保存时可以保存在-80的条件下，是生物样品检测中最常用的样本。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了保存，常会加入防腐剂。体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢物及其缀合物等形式排出。尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。,4尿液,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,唾液中所含成分比较简单，且容易获得，但是只有少数药物的唾液浓度和血浆游离药物浓度具有相关性，实际使用不多，当药物血浆结合率高的时候，唾液中药物的浓度极低，很难检测。,5唾液,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短期保存，可4冷藏；长期保存，可-20冷冻，不要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。,生物样品的保存：,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和测定方法三个方面的问题。,三、常用的处理方法,1.沉淀蛋白PPT2.液液萃取LLE3.固相萃取SPE,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,1.沉淀蛋白,有机溶剂沉淀法加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90%以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离心10min便可将析出的蛋白质完全沉淀。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶剂，涡旋离心后，取上清进样；若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影响很大；常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提取法常并用，药物的回收率较高。,加入中性盐,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,20,加入强酸,当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。常用的强酸有：10%三氯醋酸等。血清与强酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用的沉淀剂有：CuS04-Na2W04,ZnS04-NaOH等。含药物血清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上清液。,加入锌盐或铜盐沉淀剂,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用酶解法。在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被有机溶剂提取，常用酶水解的方法。,酶解法,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,超速离心法平衡透析法最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的血浆蛋白结合率。,其他的一些去除蛋白质的方法：,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物，有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。,2.液液萃取法LLE,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。酸性药物的解离：AH+H2OA-+H+碱性药物的解离：B+H2OB+OH-药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa1-2个单位；对于酸性药物来说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸或氨水、氢氧化钠等。水相的PH值-影响液液萃取最关键的因素,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩；大多数药物具有脂溶性，应用范围广。缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血浆中的脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会在离子源处产生基质效应，严重干扰质谱检测结果的准确性！,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提取效果最好；若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1,1:2,1:3的使用；在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率；提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,举例：雌二醇的检测取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80冷冻10min，倒出上层有机层，40水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80冷冻10min，倒出上层有机层，40水浴氮气吹干，流动相复溶。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,固相萃取(SolidPhaseExtraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。,3.固相萃取SPE,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,固相萃取的基本原理和方法：SPE技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,固相萃取操作一般有五步：活化甲醇/乙腈润湿小柱，活化填料；平衡水或适当缓冲液冲洗平衡小柱；上样将样品转移上柱，抽去废液；淋洗水或缓冲液最大程度洗去干扰物；洗脱用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,1.正相色谱原理2.反相色谱原理3.离子交换原理,根据原理分类：,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,SPE方法的优点：1.不会发生乳化；2.适用范围广；3.提取效率高；4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物；5.溶剂消耗少；6.易于实现自动化；7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度的分离出药物，去除干扰。目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已经广泛应用。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,三种方法的比较：,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,将药物进行化学衍生化的目的是：使药物变成具有能被分离的性质；提高检测的灵敏度；增强药物的稳定性；提高对光学异构体分离的能力等。药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。,4.化学衍生化法,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化，影响分离。柱后衍生化是药物经色谱柱分离之后进行的，所以可形成对检测器具有高灵敏度的衍生物。HPLC法常用的衍生化试剂有邻苯二醛、丹磺酰氯、荧胺等。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,定量下限达10pg级别！,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件,体内药物分析方法的建立,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,1.光谱分析法2.色谱法3.毛细管电泳法4.免疫分析法5.同位素法,体内药物分析方法大致可归为一下几类：,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物的HPLC-MS/MS分析方法开发的一般流程：,1.查阅相关文献资料，了解药物的理化性质，选定内标物质；2.使用标准品，扫描质谱条件；3.选择色谱柱和流动相，摸索合适的液相条件；4.依据样品基质，配制模拟生物样品，选择相应的样品处理方法，处理后进样分析；5.调整样品处理方法或液相条件，并可进一步优化质谱参数；6.根据检测目的，设定定量范围，对方法进行考察。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,方法学验证（validation）,生物样品测定的关键是方法学的确证。方法学确证是整个药代动力学研究的基础。这是药代动力学研究有别于其它药理毒理研究的特殊之处。所有药代动力学研究结果，都依赖于生物样品的测定，只有可靠的方法才能得出可靠的结果，因此必须对所建立的方法进行验证。并且在实际样品检测过程中还应进行方法学质控，制备随行标准曲线并对质控样品进行测定，以确保检测方法的可靠性。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,Guidelineonbioanalyticalmethodvalidation-EMEA,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,4.校正曲线Calibrationcurve,结果要求：校正曲线应至少包括六个浓度点以及一个MatrixBlank和一个ControlZero点（仅作参考，不纳入校正曲线的计算），必要时可以做双份测定；各个浓度点的准确度应在85%-115%之间，精密度应小于15%，定量下限处为80%-120%和20%；对不符合要求的浓度点可以排除计算，但至少有75%以上的浓度点符合要求；方法验证期间应至少提供三条以上的合格的标准曲线纳入统计。,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证,质控样品QualityControl，QC,将标准品加入到生物基质中配制成的模拟生物样品，用作方法学验证中的考察样品和样品测定中的方法学质控。低浓度质控(LowQC)浓度不超过LLOQ的3倍；中间浓度质控(MediumQC)浓度一般为定量范围的中间浓度；高浓度质控(HighQC)浓度至少为ULOQ的75%。质控样品推荐由独立人员一次性配制，进样分析合格后分装，冰冻储存，