基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因1、 基因克隆及转基因过程1、 设计引物软件是DNASTAR.Lasergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。）不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。步骤：一、打开PrimerSelect和EditSeq。二、在EditSeq中输入你的序列。引物有一对F和R1、对于F是从5到3，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择EnterNewPrimer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。3、对于R是从3到5，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。2、 提取醋栗DNA3、 PCR扩增与目的基因回收PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。PCR：20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul； 10乘Taq buffer2.0ul； 引物F、R各0.5ul； 模板1ul；若为质粒0.5ul就够； 最后加入Taq酶0.2ul，Taq酶现用现拿。过程：我们用的是预变性943min； 然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性9430s，退火 退火温度下30s，延伸72时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb； 循环完成后， 此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72延伸； 最后4保存待用。 4、双酶切回收没问题就将回收的目的基因和表达载体质粒进行双酶切。目的基因回收完可以直接用试剂盒提纯，因为就切下来很少的几个碱基，试剂盒柱上挂不住。表达载体质粒酶切完要琼脂糖凝胶回收，回收大的片段。回收完检测一遍。4、 连接5、 大肠杆菌转化大肠杆菌感受态用的是DH5。步骤：（1） 打开42水浴锅。（2） 把感受态放在冰上化，不能放太久，将质粒（连接产物）加感受态细胞50ul，指尖混匀。（3） 在冰上放3040min。（4） 90s严格计时，放入水浴锅热激（42），之后立即放冰上12min，之后加入500ul纯净LB液体培养基（37最好），混匀。（5） 放入37摇菌箱，45min1h（180200rpm）（这一步的目的是菌恢复活性）。（6） 离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB卡那抗生素的固体培养基）。（7） 放入37培养箱，倒置。 涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。7、 挑菌及摇菌长出单菌落后，超净工作台里挑菌，将菌挑在20ul的灭菌水中作为模板进行菌落PCR。将检测没问题的菌进行摇菌。摇菌步骤：把菌液分别倒入摇菌管中（10ml的摇菌管），再加入4mlLB液体培养基，加入4ul卡那（始浓度50mg/ml，终浓度50mg/L），放入摇床中（37）过夜摇菌。8、 保菌及提质粒将摇的菌在超净工作台里分为三部分：（1） 保菌：500ul菌+500ul 50甘油，混匀，放入-80超低温冰箱保存，备用；（2） 测序：1ml菌用于测序；（3） 提质粒：剩下的菌用试剂盒提质粒。有时也送一部分提的质粒去测序。9、 农杆菌转化没问题的质粒转入农杆菌感受态细胞（EHA105），步骤：（1） 打开37水浴锅；（2） 取2ul质粒+50ul或100ul感受态细胞，冰上放置30min；（3） 液氮中冷冻1min；（4） 37水浴溶化细胞；（5） 加500ul1ml纯净LB液体培养基，混匀；28摇床培养2h（180200rpm）；（6） 离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB卡那抗生素+Rif抗生素的固体培养基）。（7） 放入28培养箱，倒置，培养23天。 涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。10、挑菌及摇菌挑菌及菌落PCR同7。摇菌时加4ml LB液体培养基，4ul Kan，8ul Rif。摇菌大约40多小时。（此步为小摇）11、 保菌将摇的菌取500ul+500ul 50的甘油保菌。再用大三角瓶进行大摇，摇菌取1ml菌液+100ml LB液体培养基+100ul Kan+200ul Rif，过夜摇菌。12、 配侵染液侵染步骤参考论文优化而来。 （1）配侵染液200ml：5蔗糖，0.02%L-77（有剧毒），有点难溶；（2）大摇后的菌液测OD，要在0.81.0之间，高于这个值时死菌过多，侵染成功率低；（3）将菌液倒入大点的离心管离心；（4）倒掉上清，用枪把残余的上清吸净，加入少许（4、5ml）侵染液，用枪把菌打散打匀，倒入瓶中。13、侵染铁托盖上报纸，润湿，需用到黑塑料袋，戴上手套。选择花骨朵多的拟南芥，不是花开的多的，要没开的多的拟南芥，用于侵染的拟南芥一般是四株长在一个小花盆中。将所有花全泡到侵染液中，所有花均需沾湿，漏在外面的花用戴手套的手弄湿，泡2min即可（注意不要沾到土，否则植物会死）。然后将植株迅速平躺放到铁托中，用黑报纸盖住。最后暗处理24h，第二天拿出来后正常培养。注意：用于侵染的液体有菌和毒，避免碰到身上。 用于摇菌的瓶子，侵染的瓶子都要高温灭菌；用于装侵染液的瓶子最好用84消毒，要不用洗洁剂也行。到这时就完成整个转基因过程了。14、 收种子侵染后的植株看做T0代，侵染后1个月收种子，侵染后40天收第二批种子，但第一批最主要。是将种子收到1.5ml离心管中，晒干710d才能种。15、 筛选T1代将种子铺到加入抗生素卡那和头孢的MS固体培养基中。步骤： （1）将种子放入中等EP管（10ml）中。加满消毒液（0.5%SDS，0.8%NaClO3），手摇振荡15min。（2） 在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，振荡洗涤，将种子完全打散。（3） 大离心机离心（3000g for 2min at 20），要