PCR详细解PPT课件

.,1,PCR,.,2,PCR（PolymeraseChainReaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。,.,3,DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。,PCR的基本原理,.,4,PCR扩增体系,模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以是细菌、组织样品等。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。DNA聚合酶（DNAPolymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。Mg2+、K+、增强剂,.,5,1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（4565，30s）。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（72，3060s）。,PCR的基本原理,.,6,.,7,.,8,高温变性,.,9,低温退火,.,10,中温延伸,.,11,.,12,.,13,.,14,理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106107。,.,15,PCR扩增曲线,1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上搜索互补序列，并与特定位点杂交。2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。,.,16,PCR扩增条件,循环,.,17,PCR反应条件945min9430s56.230s7230s727min4,PC1-P20：模板：基因组DNA；产物：506bp,举个例子,PCR体系（10L）模板：1L上游引物：0.2L下游引物：0.2LEasyTaq酶：0.1LEasyTaqBuffer：1LdNTP：0.8LddH2O：6.7L,30个循环,.,18,1.避免PCR试剂的污染2.最适合的反应条件3.设置对照组：PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。,PCR的注意事项,.,19,1.为什么完全没有PCR扩增产物？试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。PCR仪温度控制不精确。模板DNA发生降解。引物或反应温度设计不合理靶片段GC含量过高或扩增对象长,常见问题,.,20,2.为什么出现多条非特异性条带？反应体系被污染。引物特异性差。退火温度不合适。,常见问题,.,21,3.为什么PCR产物很少？聚合酶活性过低。循环次数偏低。模板DNA浓度过低。,常见问题,.,22,4.为什么PCR产物出现片状拖尾？DNA聚合酶过多或酶活性差。dNTP和Mg2+浓度过高。退火温度过低，PCR循环数偏多。模板DNA用量过大或模板DNA不纯。引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特异扩增。,常见问题,.,23,普通PCR仪,温度梯度PCR仪,.,24,实时荧光定量PCR仪,.,25,引物设计,.,26,为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计的目的,.,27,1、引物应具有足够的特异性。如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。NCBIPrimerBLAST,引物设计的基本原则,.,28,2、避开易形成二级结构的模板序列区域。分子内互补、发夹结构、分子间互补。二级结构会增加引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。,引物设计的基本原则,.,29,.,30,3、引物长度一般为18-30个碱基之间。引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。过短：扩增特异性下降过长：引物自身形成二级结构，以及引物二聚体。,引物设计的基本原则,.,31,4、G+C含量一般为40%-60%引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。,引物设计的基本原则,.,32,5、Tm值之差应小于1，最适退火温度在55-60。一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。对于20bp左右的引物：Tm（）=2（A+T）+4（G+C）一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5左右。,引物设计的基本原则,.,33,6、引物中四种碱基最好是随机分布的避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧啶的重复。特别是引物的3端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。,引物设计的基本原则,.,34,7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身互补发夹结构引物之间互补二聚体引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3端的互补重叠。,引物设计的基本原则,.,35,8、引物的5端可以修饰，3端不可以修饰。引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。由于延伸是从3端开始的，所以不能进行任何修饰。,引物设计的基本原则,.,36,9、引物的3端不可以A结尾。引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。,引物设计的基本原则,.,37,10、引物3端要避开密码子的第3位。如扩增序列位于基因编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。,引物设计的基本原则,.,38,1、避免重复碱基，尤其是G。2、引物退火温度在58-60之间。3、G+C为30-80%。4、3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。5、引物的产物大小一般在80-250bp之间；80-150bp最为合适（可以延长至300bp）。,Real-TimePCR引物设计原则,.,39,6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。7、Real-TimePCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNA污染影响。,Real-TimePCR引物设计原则,.,40,PrimerPremier5.0Oligo6Primer3（在线）Primer-BLAST（在线）,引物设计常用软件,.,41,粘贴模板序列,.,42,.,43,引物搜索,.,44,引物位置,产物大小,引物长度,.,45,.,46,.,47,.,48,.,49,.,50,.,51,Oligo,.,52,.,53,.,54,.,55,.,56,PrimerBLAST,.,57,.,58,.,59,.,60,.,61,逆转录PCR,.,62,由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录PCR（ReverseTranscriptionPCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。,逆转录PCR的原理,.,63,逆转录PCR的原理,.,64,逆转录PCR的反应体系,1、模板RNA2、逆转录酶3、逆转录引物,.,65,.,66,.,67,.,68,93-96，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含G+C的靶序列而言。,.,69,退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCR的方法进行摸索。,45.045.546.949.051.453.856.258.660.963.164.565.0M,PC1-P20退火温度摸索,.,70,延伸的温度通常为所以DNA聚合酶的最适工作温度，一般为72；延伸的时间主要取决于目的片段的大小，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与DNA聚合酶的种类有关。EasyTaq：1-2kb/minTransStartTaq:1-2kb/minFastPfu:2-4kb/min,.,71,循环数：在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-35个循环即可。循环数太多：会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。循环数太少：PCR产量太低。,.,72,逆转录引物：（1）随机六聚核苷酸引物仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合体。所有RNA分子均可以充当模板，合成的cDNA中有96%来自rRNA。,.,73,逆转录引物：（2）Oligo（dT）仅由dTTP构成，长度一般为18-24个核苷酸。识别mRNA的3端poly（A）尾，因此仅mRNA可被逆转录。,.,74,逆转录引物：（3）特异性引物能与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸引物，仅产生待分析基因的cDNA。,.,75,半定量RT-PCR,.,76,基本概念,半定量RT-PCR（semi-quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,SqRT-PCR）是常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法，通过mRNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特异mRNA的相对数量。定量RT-PCR（quantitatiereversetranscriptionandpolymeraseChainreaction,qRT-PCR）是在用一步法或两步法，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,.,77,灰度值（IOD值）用凝胶成像系统自带的分析软件分析目的条带的平均密度值，也称为灰度值。是density和area的乘积。平台效应PCR扩增属于酶促反应，所以，DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。靶DNA片段的扩增最初表现为直线上升，随着靶DNA片段的逐渐积累，当引物-模板/DNA/聚合酶达到一定比值时，酶的促化反应趋于饱和，此时靶DNA产物的浓度不再增加，即出现所谓平台效应。管家基因持家基因(house-keepinggenes)：又称管家基因，是指所有细胞中均要表达的一类基因,其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。管家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。,.,78,基本原理,PCR扩增反应是酶促反应，遵循酶促动力学原理，开始的循环内扩增产物呈指数积累，产物与模板呈线性关系。半定量RT-PCR技术正是利用产物与模板量的这一线性关系，通过扩增产物来对比总RNA中目的基因的表达。,.,79,基本流程,.,80,注意的问题,RNA的提取做RT前必需测RNA浓度，常用500ng或1ug。A260/A280和A260/A230A260/A280在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，当用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐（胍盐）等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。如果RNA样品的260/280=1-1.5,260/230=1-1.5，那么污染原因就应该考虑是酚残留。如果RNA样品的260/280=2，260/2301，那么污染原因就应该考虑是胍盐残留。,.,81,注意的问题,RNA的电泳图谱一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是如果仅仅是为了检测RNA的质量，用普通的琼脂糖胶就可以了。电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，RNA的质量是好的。,注意的问题,.,82,注意的问题,引物设计所设计引物的扩增效率和特异性要好，一般选择在基因的cds区域设计引物，在可能的情况下将PCR引物置于基因的不同外显子上以消除基因和mRNA的共线性。,注意的问题,.,83,注意的问题,内参的选择为了客观地比较不同样本中目标基因表达量的相对多少，消除由于反转录时总RNA浓度差异造成的误差，要选择合适的Control基因。经常用于RT-PCR法的Control有：GAPDH、-actin、18SrRNA、28SrRNA等,.,84,注意的问题,同管扩增或异管扩增的选择同管扩增的优点：保证扩增效率一致。缺点：两种基因相互竞争，会影响扩增的进程。分管扩增的优点：保证每个基因的扩增进程优化。缺点：扩增效率不能保证一致。,注意的问题,.,85,注意的问题,PCR循环数的确定最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。actin和GAPDH28-30，否则增加模板量,注意的问题,.,86,注意的问题,其他扩增条件固定（时间）循环数、循环时间、变性时间、退火和延伸、升降温的速度体系固定（PCRmix）dNTPs、引物、反应模板、DNA聚合酶PCR仪固定凝胶浓度EB浓度梳子的选择扫胶（曝光）,注意的问题,.,87,结果分析,将要比较的两个样品的内参调成一样的亮度；根据扩增内参时加入的cDNA量，进行目标基因的PCR扩增；电泳扫描后，计算灰度值，先用一个标本的目标和内参进行比较，然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较，一般每组3个样本以上。,结果分析,.,88,实时荧光定量PCR技术介绍(RealtimeQuantitativePCR),.,89,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,.,90,实时荧光定量PCR原理实时原理,常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,.,91,实时荧光定量PCR原理定量原理,介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,.,92,实时荧光定量PCR原理-扩增曲线,.,93,实时荧光定量PCR原理-荧光阈值,荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段真正的信号:荧光信号超过域值,.,94,实时荧光定量PCR原理-Ct值,Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,.,95,实时荧光定量PCR原理-Ct值的重现性,Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性,.,96,实时荧光定量PCR原理-标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,.,97,非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon,实时荧光定量PCR原理-DNA产物的荧光标记,.,98,实时荧光定量PCR方法1-SYBRGreen法,.,99,SYBRGreen法工作机理,SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位,SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBRGreen,.,100,实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理,.,101,实时荧光定量PCR方法2-Taqman探针法,.,102,实验方法,RealTimePCR严格上可以区分为DNA起始的RealTimePCR和RNA起始的RealTimeRT-PCR。,.,103,实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析,.,104,SYBRGreen法融解曲线分析,.,105,Cyclenumber,SYBRGreen法定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,.,106,SYBRGreen法-引物设计,.,107,SYBRGreen法-PCR反应的建立,反应体系的建立及优化:SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数:由酶和引物决定其他与常规PCR相同,.,108,SYBRGreen法-PCR反应性的确认,.,109,SYBRG