肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势-郭晓明

免疫学概论课程论文肿瘤基因治疗的研究进程及发展趋势姓 名： 郭冬阳 学 号： 200904123100* 学 院： 材料与化工学院 专业班级： 2009级生物工程（2）班 指导教师： 郑育声 分数： 2012年12 月30 日摘要肿瘤的基因治疗就是将一个治疗基因“捆绑”在“病毒”上，随后将这种载有治疗基因的“病毒”感染肿瘤患者或肿瘤细胞，使治疗基因进入肿瘤细胞，进而“摧毁”肿瘤细胞。这种肿瘤的治疗技术已成为现代广大肿瘤学者的研究热点，其具有特异性、安全性、有效性的特点而受到越来越多的关注，而且许多实验及临床研究取得了满意的效果。本文将从肿瘤基因治疗的方法、我国肿瘤基因治疗的现状及发展趋势等方面进行论述。关键词：肿瘤；基因治疗；研究进展；发展趋势基因治疗是以改变遗传物质为基础的DNA重组技术，需要将目的基因传递到细胞内，这一过程必需载体的协助才能达到目的，因此载体在基因的转移中担任重要角色。随着免疫学的发展和基因技术研究的不断加深，结合病毒载体、免疫基因和转基因等方法在肿瘤的基因治疗中取得了许多成就，为肿瘤的治疗展现了广阔的应用前景。一、肿瘤基因治疗11 肿瘤基因治疗的策略（1）免疫基因治疗，又称细胞因子基因治疗，通过转导细胞因子基因，增强机体抗肿瘤免疫能力；（2）自杀基因治疗，使肝癌细胞产生对某些药物前体的特异敏感性而被杀；（3）基因置换或补充，置换突变的基因或补充缺失的抑癌基因；（4）反义苷酸技术，用于抑制癌基因的表达。12 肿瘤基因治疗基因工程的程序 首先取得所需要的基因即目的基因，将其同载体连接，再将经过重组的环状DNA即质粒引入受体细胞，并使目的基因和载体上其他基因的性状得以表达等几个环节。（1）在内切酶的作用下分离制备待克隆的DNA片段；（2）将目的基因与载体在体外连接形成重组DNA；（3）重组DNA进入宿主细胞；（4）筛选、鉴定阳性重组子；（5）重组子的扩增。13 肿瘤基因治疗基因工程所需的载体虽然内切酶解决了异源DNA体外重组的技术问题，但是重组之后的异源DNA还必须回到细胞内才能显示出其生物活性。这就要求有一种运送载体来充当此角色。微生物中有一种非染色体一种环状DNA或病毒可以做为载体，这样载体的共同特点是：（1）它们都是环状DNA；（2）都能专一性的感染某一细胞；（3）都具有某种选择性标记；（4）都具有一些内切酶的酶切位点；（5）都可以随染色体的复制而独立复制，随着细胞的分裂而扩增。14 肿瘤基因治疗基因工程所需的工具酶 只有在DNA限制性内切酶、载体质粒、连接酶及其它修饰酶的作用下，才能实现随心所欲地移动和改造基因。内切酶的共同特点是：它们都有专一性的DNA识别顺序，都能在DNA链当中切开DNA，故称“内切”的酶。但切开的方式有两种：（1）切成粘性末端；（2）切成平末端。基因工程研究就是利用了内切酶可以专一性地把DNA切割成特定的粘性末端的特点，根据研究工作的实际需要，把一些不同来源，具有粘性末端的DNA片段重新连接或组合起来，这就是DNA技术的来由。15 肿瘤基因治疗基因工程所需的细胞 293细胞是传染腺病毒ELA基因的人胚肾上皮细胞系，有致瘤性，是转化细胞。细胞感染病毒后，首先是细胞形态的变化，由于病毒能增强细胞膜的渗透性，细胞外的离子钠离子流入胞内，细胞可从原来的形态变为圆形，然后由于细胞支架的降解或破裂导致细胞从基质上脱落，最后破裂。二、肿瘤基因治疗的常用方法21 基因沉默疗法RNA干扰是指在生物体细胞内，与靶基因同源的外源性或内源性双链诱导转录后引起特异性基因沉默。现已阐明RNAi发生机制的大致模型。1)启动阶段：长dsRNA 或短发夹RNA进入细胞后，在一种具有RNase活性的dsRNA特异性核酸内切酶作用下，被切割为2123个核苷酸组成的片段，即siRNA。2)效应阶段：siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成RNA诱导沉默复合物，识别mRNA，其中的反义链与靶mRNA互补结合，正义链则被置换出来。继而，RISC中的Dicer在靶mRNA与siRNA结合区域的中间将其切断。3)级联放大：在RNA依赖性RNA 聚合酶的作用下，以mRNA 为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，从而使效应阶段反复发生，一个完整的mRNA就被降解成2l-23 nt的小片段，导致相应的基因表达沉默。22 自杀基因疗法自杀基因疗法也称前药转换酶基因疗法，是指将某些病毒的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶能将对细胞无毒或毒性极低的药物前体在肿瘤细胞内代谢成细胞的毒性产物，以达到杀死肿瘤细胞的目的。自杀基因治疗系统的种类很多，主要包括单纯疱疹病毒I型胸苷激酶丙氧鸟苷系统、带状疱疹病毒胸腺嘧啶激梅新华 肿瘤基因治疗的研究进展酶阿糖甲氧基嘌呤系统、胞嘧啶脱氨酶5一氟胞嘧啶系统和硝基还原酶系统等。目前研究较多的是HSV tkGCV 系统，研究者正在致力于提高自杀基因疗法的效率。在自杀基因的探索中，不少究者发现，少量的自杀基因转染的癌细胞与未转染的癌细胞按一定的比例混合后培养，不仅转染的癌细胞被杀灭，两者相互接触后相邻的未转染癌细胞也大量死亡，此即“旁观者效应”。治疗中，“旁观者效应”是一重要特征，即有毒代谢物通过缝隙连接或凋亡小体从转染细胞移动到邻近细胞，对其产生杀伤作用，大大提高了自杀基因的杀伤效应。23 免疫基因疗法免疫基因治疗是通过基因重组技术，增强机体的抗肿瘤免疫功能，达到治疗肿瘤的目的，主要包括增强免疫效应细胞功能的细胞因子基因疗法、调节增强抗原识别能力的主要组织相容性复合物的基因疗法和共刺激分子基因疗法等。在肿瘤免疫治疗中，免疫活性细胞的免疫监督和杀伤活性起着重要作用。细胞毒淋巴细胞对肿瘤细胞低反应性的一个主要原因是肿瘤细胞表面共刺激分子B-7家族的低表达，导致CD28和CD152以及B-7之间相互作用减弱。细胞毒性T淋巴细胞是免疫系统的主要效应细胞，其介导的细胞毒作用需要识别细胞表面的T细胞抗原受体和主要组织相容性复合体分子。相反，Fas-FasL介导的细胞毒作用无特异性。因为肿瘤表面通常表达Fas，所以FasL和CTI 是抗肿瘤的两大武器。在肿瘤的发生发展中，肿瘤细胞通过抑制APC，特别是DC的抗原递呈作用来逃避宿主对其进行的免疫攻击。DC来源的肿瘤疫苗将是具有巨大潜力的肿瘤免疫治疗手段。24 基因替代疗法抑癌基因亦称抗癌基因，是指正常细胞内存在的能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。基因替代治疗就是利用载体将缺失的抑癌基因转染肿瘤细胞，以达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前已分离克隆出20余种抑癌基因，p53基因是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，肿瘤生成会伴随p53的缺失。目前研究的抑癌基因还有Fhit及第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酯酶等，但真正应用到临床，还需要大量的研究。sible sites，AAS)，并转染入胃癌细胞株MNK-45，实验组Survivin RNA 和蛋白水平明显下降，部分肿瘤细胞呈现凋亡的特征性改变。并且这种作用与AAS的位置有关系，提示反义Survivin能够诱导凋亡，抑制肿瘤细胞生长。分化抑制因子又称DNA结合抑制因子，属于螺旋环一螺旋转录因子家族成员之一，与肿瘤的发生、侵袭及肿瘤血管生成等方面密切相关。Id蛋白可成为肿瘤靶向治疗的一个新靶点。目前用于反义治疗的基因还有Bcl-2、cerb-B2和增殖细胞核抗原等。25 反义基因疗法 反义基因疗法就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定DNA或RNA片断(反义核酸)，抑制或封闭专一靶基因的技术。Tong等在体外通过随机寡核苷酸库联合特定软件分析，选择合适的Survivin反义位点在肿瘤生成与转移中新生血管发挥重要作用，VEGF和转化生长因子是促进新生血管生成的主要生长因子，以VEGF作用最强。与其他基因治疗相比，该疗法无需直接转染肿瘤靶基因，只需转染肿瘤4周，创造抑制血管生成的环境。小鼠血管内给予针对VEGF受体的siRNA时发现，VEGF受体表达减少，肿瘤的生长速度和血管生成明显减少。26 多药耐药相关的基因疗法多药耐药(MDR)是指在化疗药物治疗肿瘤中发现的肿瘤细胞的非特异普遍耐药性。导致肿瘤细胞MDR 的一个重要原因是MDR1基因扩增和过度表达。MDR相关的基因治疗一般集中在抑制肿瘤细胞的MDR1基因表达，从而增加常规化疗的效果。郭华等以MDR1基因mRNA为靶点设计合成2个反义肽核酸(PNA)序列，利用PNA-DNA 杂交，阳离子脂质体介导转染脑神经母细胞瘤耐药细胞株SK-N-SH。检测显示，SK-NSH 细胞P-gP表达明显降低，MDR1mRNA表达轻度下降，细胞内多柔比星(ADM)聚集浓度明显增加，PNA在MDR1基因抑制中的特殊作用为逆转肿瘤的MDR提供了新的途径。缺氧诱导因子1(HIF 1)对于肿瘤MDR 形成有多方面的作用，以HIF-1为靶点的肿瘤治疗，为克服肿瘤放、化疗抵抗提供了新思路。27 抗肿瘤新生血管形成疗法反义基因疗法就是根据碱基互补原则，用人工合成或生物体表达的特定DNA或RNA片断(反义核酸)，抑制或封闭专一靶基因的技术。Survivin是一种凋亡抑制基因，它在正常组织中不表达，而在胚胎发育组织和多数人类肿瘤组织中均有程度不同的表达。28 抗端粒酶疗法端粒是位于染色体末端的复合结构，调控细胞的有丝分裂，随着细胞分裂将逐步缩短，最后导致细胞凋亡。故端粒的持续存在是肿瘤细胞增殖的基础。端粒酶是一种逆转录酶，能够以自身RNA为模板合成端粒的末端重复序列5-TTAG-3 ，以补偿端粒片段的缺失，在正常组织中通常处于抑制状态，但在恶性肿瘤和永生化的细胞中常处于激活状态。人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶的活性限速成分。迄今已发现6种类型的核酶，其中锤头状核酶由于结构简单，设计方便，成为基因治疗的首选。三、我国肿瘤基因治疗的现状 我国是较早开展基因治疗研究和临床试验的国家。早在1985年，吴曼院士就提出了肿瘤是基因治疗的重要目标。经过几十年的发展，在基因导入和基因治疗研究和临床试验等方面都取得了很大进展，目前我国已有重组腺病毒-p53抗癌注射液,TK基因治疗恶性脑胶质瘤,以树突状细胞为基础的肿瘤细胞治疗与基因治疗、IL-2基因工程胃癌细胞瘤苗、HSV-tk基因治疗肝癌等几个肿瘤基因治疗方案进入了临床试验阶段，并建立了生物领域病毒载体研发基地，主要开展腺病毒相关病毒载体用于治疗肿瘤的实验和临床试验研究。目前我国已经有30余个具有自主知识产权的基因治疗方案，并在进行临床试验。四、肿瘤基因治疗的发展趋势近年来，载体系统的不断完善和发展，相关的基因治疗研究和试验报道层出不穷，然而真正意义上的突破却不容乐观，主要有：（1）没有十分理想的治疗基因，不同个体发生肿瘤免疫逃逸的机理可能不同，目前还没有一个公认的与癌症的发生、发展密切相关的基因。（2）体内基因传染效率较低，限制了治疗基因的表达。（3）对肿瘤发病机理的认识还远远不够。（4）导入的目的基因难以控制，肿瘤细胞的靶向性不强，损害正常细胞的功能。根据以上目前肿瘤基因治疗的研究主要集中在：（1）寻找新的更有效的治疗基因；（2）寻找更好的载体增加传染效率；（3）选择更合适的导入途径。 总之，由于肿瘤是多因素、多环节、多阶段的复杂的基因疾病，依靠单一方法并不能达到理想的抗肿瘤效果，因此多种治疗联合、针对肿瘤的不同特征进行个体治疗也已成为基因治疗发展的一个趋势。参考文献1 杨家驹，段振玲，肿瘤的基因治疗进展，医学综述，2005，11（10）：883-8852 刘宾娜，肿瘤的基因治疗，牡丹江医学院学报，2007，28（5）：72-743 李允光,濮德敏,刘雪梅等RNAi沉默环氧酶-2对宫颈癌Hela细胞细胞周期影响的实验研究J中华肿瘤防治杂志，2007.14(20)：1535-I5384 Sioud MTherapeutic siRNAEJTrends Pharmacol Sci，2006，27(1)：22-285 Okada T，Caplen N J，Ramsey W J，et a1In situ generation of pseudotyped retroviraI progeny by adenovirusmediated transduction of tumor cells enhances the killing effect of HSVtk suicide gene therapy invitro and in vivoJJ Gene Med，2006，8(3)：288-2996 何霞，周俊宜，朱振宇，等端粒酶锤头状核酶抑制肺癌细胞端粒酶活性及细胞增殖的实验研究J.中华肿瘤防治杂志，2007,l4(18)：l372-13757Ye J，W u Y L，Zang SInhibitory effect of human telomerase antisense variant tumor pathological subtypeJWoed J Gastroenterol，2005111(15)：223O 22378 关心，彭吉润，冷希圣.人树突状细胞与肝癌细胞系HIE融合细胞的建立。中华肿瘤杂志，2005，27(8)：