时间分辨荧光免疫分析技术

.,时间分辨荧光免疫分析技术,王征达瑞抗体,.,标记免疫学分析技术发展历程,免疫荧光分析(Coons,1941)放射免疫分析(Berson和Yalow,1960)酶免ELISA(Engvall,1971)金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)化学发光免疫分析(Arakawa，1977)时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila，1979)电化学发光免疫分析(Leland,1990)液相芯片(美国Luminex公司,1997),.,.,标记免疫技术的理论检测灵敏度,放射免疫10-10-10-12mol酶联免疫10-9-10-10mol化学发光10-15mol时间分辨荧光10-18mol电化学发光10-18mol,.,一、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）（Time-resolvedfluorescenceimmunoassay）,背景介绍基本原理技术特点反应模式,.,背景介绍,1979年，芬兰Wallac公司研发部的Soini和Hemmila首次提出了建立稀土离子标记物的“时间分辨荧光免疫分析”理论1983年，Soini和Kojola首先开发出以镧系元素为示踪物的时间分辨荧光测量仪，建立了新的非放射性微量分析检测技术。同一年，Pettersson等人运用此仪器首次对人绒膜促性腺激素(hCG)进行了时间分辨荧光免疫分析1984年，Hemmila确定了DELFIA(DissociationEnhancedLanthanideFluoroimmunoassay)这种时间分辨免疫分析技术方案,从而使DELFIA成为Wallac的专利技术1988年，加拿大CyberFluor公司的Diamandis创立了一种不同于DELFIA的时间分辨荧光免疫分析，即FIAgen2003年，时间分辨荧光分析技术获国家科技进步二等奖,.,基本原理,三价稀土离子包括有铕(Eu)，钐（Sm)，铽(Tb)，镝(Dy)等，它们的荧光光谱具有特异性强Stokes位移大寿命长的特点DELFIA采用异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕(DTTA-Eu)为双功能螯合试剂，其一端螯合Eu3+，另一端可与蛋白质的-NH2连接。在中性或接近中性pH条件下，DTTA与Eu3+具有足够的螯合稳定性，而在增强液（呈酸性）作用下，DTTA-Eu又能将螯合的Eu3+迅速、彻底地释放出来并与增强液中的配体螯合进入胶束的疏水内核，使Eu3+荧光得以成千万倍地放大FIAgen采用的是以Eu3+螯合物配基BCPDA为标记物，通过检测其与过量Eu3+形成的螯合物荧光进行定量。由于BCPDA的可检测性不够理想，FIAgen需要利用生物素-亲合素信号放大来弥补BCPDA检测灵敏度的不足,.,DELFIA标记技术,碱性,.,时间:(s）,0,400,800,1000,340nm激发光,第二个循环,荧光,短寿命荧光,613nm长寿命荧光,延迟时间,测值时间,通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到0,.,300,400,500,600,荧光强度,激发光,发射光,波长(nm),.,Tb,Dy,Eu,Sm,500,发射光强度,200,400,0,延迟时间(s),发射光强度,0,延迟时间(s),.,TRFIA技术特点,极长的荧光衰退时间铕：730000nsStokes位移大铕：激发光340nm，发射光613nm狭窄的发射峰解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍,.,固相包被抗体,铕标记抗体,孵育,待测抗原,+,+,+,增强液,+,双抗体夹心法示意图,.,双抗原夹心法示意图,+,+,+,增强液,+,固相包被抗原,待测抗体,铕标记抗原,.,中和法示意图(回滴定法),+,Eu,+,待测抗体,铕标记抗体,中和抗原,.,小分子抗原竞争抑制示意图,固相包被二抗,+,增强液,+,+,一抗,.,时间分辨技术重点和难点,固定相（96孔板）标准品铕标记物,.,二、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）测试仪,.,目前的TRFIA测试仪：,国外仪器（Wallac公司）国内其他公司生产的仪器(上海新波、广州丰华等)达瑞抗体公司自主研发的仪器及软件（DR-M6601）,.,WallacAutoDELFIA1235,.,半自动VICTOR21420,.,半自动AN