动物细胞与组织培养干细胞.ppt

华侨大学生命工程系柳建福，1，胚胎干细胞，造血干细胞，神经干细胞，间充质干细胞，华侨大学生命工程系柳建福，2，干细胞的相关特性，1，形态及生物化学特征形态上一般圆形或椭圆形，小尺寸，核物质比例大的干细胞端粒酶活性高也可以减少基因突变的可能性。自我稳定性-干细胞自我再生使自己的数量保持不变。这是干细胞与肿瘤细胞区别的本质特征。华侨大学生命工程系刘建福，3，干细胞(stemcell)是一种具有自我复制能力(self-renewing)的多能细胞，可以分化为多种功能细胞。根据发育阶段，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据分化潜能的大小，可以分为万能干细胞。具有完整的个体分化潜能，可以无限增殖，可以分化为200多种细胞，形成任何组织或器官。胚胎干细胞属于这一类。多能干细胞。具有分化成多种细胞组织的潜力，但失去了发育成像间充质干细胞这样的完整个体的能力。定向干细胞。只能分化为造血干细胞或神经干细胞等一种或与之密切相关的细胞类型。第三，分化潜能和干细胞种类，华侨大学生物工程系刘建福，4，干细胞，华侨大学生物工程系刘建福，6，干细胞分裂，华侨大学生物工程系刘建福，7，正常干细胞开发，华侨大学生物工程系刘建福，8ES细胞：受精卵分裂到胚盘胞阶段时，胚胎细胞存在于胚盘胞内，这称为innercellmass。分离培养细胞团的细胞。在一定条件下，这些细胞可以在体外“无限期”增殖，繁殖，保持其全能性。EG细胞从原始生殖细胞(PGC)培养中分离出来。ES是一种高度分化的细胞，可以分化成体所有组织和器官，包括生殖细胞。ES细胞可以在体外培养成永久性细胞株，人们可以在体外进行各种遗传操作，通过核移植技术生产转基因动物。化学交替学校生物工程和柳建福，10，胚胎干细胞，化学交替学校生物工程和柳建福，11，胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)是最广为人知的有分化可能性的干细胞之一。胚胎干细胞的研究历史可以追溯到1958年。Stevens等将附着鼠标的胚胎移植到肾脏的细胞膜下，称为胚胎癌细胞(embryoniccarcinomacell)或畸胎瘤(teratocarcinomacell)的多能细胞株称为EC细胞。胚胎干细胞系成立于1981年。英国剑桥大学的埃文斯和Kaufman，美国加州大学的马丁，分别成功分离出小鼠胚胎干细胞并在体外培养。后来，其他一系列动物的胚胎干细胞，例如金黄地鼠、老鼠(1988年)、猪(1990年)、牛(1992年)、貂、兔子(1993年)等，被分离并建成。1995年，汤姆森等人从喜马拉雅猴的囊胚中分离出了世界上第一个灵长类胚胎干细胞。胚胎干细胞研究概述华侨大学生物工程系柳建福，12，1998年根据灵长类胚胎干细胞建立成功经验，从接受不孕治疗的夫妇捐赠的囊胚阶段的早期胚胎中分离出人类ES细胞。同年，Gearhart从选择性流产获得的胚胎性腺中分离出人的EG细胞。2000年，澳大利亚Reubinoff与新加坡的体外受精专家一起，成功制造了8种从人类胚胎中未分化的人类胚胎干细胞，并从体外分化实验中获得了神经干细胞。华侨大学生物工程系柳建福，13，胚胎干细胞生物学特性：a .形态特征从培养基积累到圆形或椭圆形细胞的单层或多层，岛或巢，细胞边界不明确；细胞小，核大，细胞质小，有一个或多个核因子。b .发育可能性标记有发育阶段特定的胚胎抗原(stage-specificryponical，ssea)。碱性磷酸酶(AKP)活性高。OCT-4基因表达，OCT-4基因是开发全省的标记基因。端粒酶活性高。华侨大学生物工程和柳建福，14，胚胎干细胞的生物学特性(p142-143) 1ES细胞形态和核型2ES细胞的生长特性3ES细胞的高度分化潜能，华侨大学生物工程和柳建福，15，ES细胞的全性症状：1畸胎瘤的形成，将ES细胞注入同族动物皮下3形成2类胚胎，并在非黏附基质中悬浮培养ES细胞，调节生长或增殖的细胞数量，以生成类胚胎，作为与畸胎瘤相似的多系杂交组合，有3个胚胎组织。3直接分化，通过调节ES细胞的生长环境或遗传操纵特定的基因表达，ES细胞可以直接分化为特定的系统细胞。NeuroD2和NeuroD3转移到ES细胞后，可以分化为神经细胞。形成4嵌合体，将ES细胞注入同种囊胚腔，就能形成嵌合体。华侨大学生物工程系刘建福，16，ES细胞的调控，ES细胞的调控是指提出适当的因子条件，调节ES细胞的增殖和分化，向指定方向前进。内源性调节1细胞内的蛋白质调节ES细胞分裂，ES细胞分裂能产生新的干细胞或分化功能细胞。这种分化的不对称是由细胞自身成分的不均分配和周围环境的作用引起的。细胞的结构蛋白，尤其是细胞骨架成分，对细胞的发育至关重要。2转录因子的调节对脊椎动物转录因子调节干细胞分化至关重要。胚胎干细胞的发生需要转录因子OCT4。OCT4缺失突变胚胎只能发育到囊胚期，其内部细胞不能发育到内层细胞团。白血病抑制因子(LIF)对培养的鼠标ES细胞的自我再生有效果，而对人的成体干细胞没有效果的事实表明，多属转录调控功能并不完全一致。华侨大学生物工程系柳建福，17，2，外来性调节1分泌因子间质细胞能分泌很多因子，并维持干细胞的增殖、分化和生存。TGF家族中至少有两个成员控制神经隆起干细胞分化的TGF群和Wnt信号转导途径这两种类型的因子在不同的组织甚至不同的物种中发挥着重要作用。Wnt的作用机制是通过阻止-儿茶素分解，激活Tcf/Lef介导的转录，促进干细胞分化。2膜蛋白介导的细胞间相互作用部分信号通过细胞-细胞直接接触作用。-儿茶素是介导细胞黏附连接的结构成分。膜蛋白缺口(Notch)及其配体deltana Jagged对干细胞分化也有重要影响。3整合素和细胞外基质整合素家族是将干细胞附着在细胞外基质上的最重要的分子。整合素与配体的相互作用为干细胞未分化增殖提供了适当的微环境。beta 1整合素失去功能后，上皮干细胞摆脱微环境的限制，分化为角质细胞。华侨大学生物工程和柳建福，18，ES细胞的确认，1形态检测体外培养的ES细胞形态为圆或扁圆形，全部聚集成单层或多层，形成纤毛，巢状群体生长状态。2碱性磷酸酶(AKP)活性检测的碱性磷酸酶在早期胚胎干细胞中含量高，分化细胞中活性显着降低。ES细胞表面可以检测特定的表面抗原(ssea-1)，ssea-1经常用作ES细胞识别的象征。体内分化实验可以观察同类型动物皮下注射ES细胞悬浮液，进行分割染色，从而形成畸胎瘤。华侨大学生物工程系柳建福，19，5体外分化实验培养ES细胞悬浮体，大部分囊型单纯胚体或胚体等细胞自发分化，根据培养条件和细胞密度的不同，存在差异。6核型分析主要用于检查生成的ES细胞是否有2倍体正常核型，可通过核型分析进行检查。7OCT活性检测OCT基因是开发小鼠胚胎发育早期生殖细胞谱系及体外培养的多能干细胞特异性表达的全能标记基因。使用OCT抗血清和间接免疫荧光法检测ES和EG细胞中OCT基因的表达产物。华侨大学生物工程系刘建福，20，胚胎干细胞的胚胎干细胞来源为早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞。哺乳动物早期胚胎的发育是调节型的，每个胚胎细胞都具有全能性。用胚胎细胞制作ES细胞株的原理是在囊胚期内对细胞团或桑叶进行体外培养，防止分化。1从早期胚胎的获得开始，从2原始生殖细胞获得，化学交替学生命工程和柳建福，21，化学交替学生命工程和柳建福，22，胚胎干细胞建立过程，1ES细胞分离获得2ES细胞分化抑制培养抑制细胞分化抑制手段采用养育层抑制物3ES细胞株的建立和保存，化学交替学生物工程和柳建福，23 1体外ES细胞诱导分化的优点2ES细胞体外诱导分化的基本原理3ES细胞诱导分化的方法，华侨大学生物工程与类地杂志，25，干细胞培养过程，华侨大学生物工程与类工程与类地杂志，26，华侨大学生物工程与类地，27，胚胎干细胞生物学研究的重要领域是组织工程与这部分研究称为干细胞工程。胚胎干细胞的应用前景华侨大学生物工程系刘建福，28，1动物克隆和人类治疗克隆ES细胞有无限的继代增殖，通过核移植，在细胞核移植后的短期内，可以获得许多基因型和表型相同的个体，而不改变其基因型和表型特性。华侨大学生物工程系的刘建福，29，2在转基因动物中以ES细胞为载体，在体外转化ES细胞，在细胞水平进行基因整合数、部位、表达程度及插入基因的稳定性和筛选工作。这很容易得到稳定和满意的转基因ES细胞系。华侨大学生物工程系刘建福，30，3嵌合动物的准备利用ES细胞从两个以上的合子体细胞中获得嵌合体，也称为上半身体。嵌合物种内及种间嵌合。通过基因改造技术，将不同来源的重要基因转移到嵌合体，或将理想的性状组合到嵌合体中，使嵌合体有多种生物学功能，甚至产生新的生物学功能。花序生物技术和柳建福，31，4，成人个体干细胞研究是成体干细胞研究中最有趣的部分。可以有效地防止组织排斥，避免伦理，法学院的争论。1.成体干细胞和胚胎干细胞具有相同的分化潜能吗？很多动物实验证明成体干细胞具有很强的分化能力。例如，recenterimensinmicescuggestthatwhenneuralstemcellswereplacentthebonmarrow，theyapparedtoproduceavarieteyofblookcelltypees交替生物技术和柳建福，32，成年大鼠未发育的脑干细胞到肌肉细胞la cobi和GiulioCossu，theinstituteforstemcellresearch inmilan 200920也对成人志愿者的神经干细胞进行了同样的工作。华侨大学生命工程系柳建福，33，withsasongintheirheads-birchofvenbraincellsindudinbirds，华侨大学生命工程系刘建福，34，影响成体干细胞应用的几个因素：b .成体干细胞的含量很低，很难分离和纯化。c .对于某些患者，可能：疾病的进行没有等待干细胞的充分培养；患者自己的基因组有遗传缺陷。华侨大学生命工程系刘建福，35，ES细胞研究面临的难题1，培养ES细胞必须在快速无限增殖的同时未分化。2，ES细胞没有高度分化，有可能形成畸胎瘤。诱导ES细胞分化为单一类型分化细胞的方法是尚未解决的问题。3、ES细胞实际用于器官克隆和移植仍需要技术上的突破。器官的形成是一个非常复杂的三维过程，因为很多器官是由两个不同胚胎的组织相互作用而形成的。4、最大的障碍是伦理学，特别是ES细胞应用受到伦理、宗教、法律和社会因素的强烈反对，一些国家明确禁止人类ES细胞研究。华侨大学生命工程系刘建福，36，造血干细胞(HSC)主要存在于红色骨髓中，在胚胎卵黄囊的血岛细胞中增殖、分化和转移。造血干细胞，化班生命工程和柳建福，37，化班生命工程和柳建福，38，造血干细胞开发，化班生命工程和柳建福，39，生物学特性：a .高度的自我复制能力HSC的自我复制能力维持到正常机体的生命末端。自我复制率一般为50%，也就是说，只有一半分裂的初级细胞保持干细胞特性，另一半离开干细胞池进入增值分化口。如果两者都失去平衡，就会产生病理造血。b .多向分化能力HSC具有多种分化潜能，可以分化为多种血细胞。c .非均匀性HSC不是由单个细胞群组成的，而是由不同发育阶段的干细胞组成的。目前通过各种技术精制的HSC在功能、生物物理特征、表面标记方面不完全一致，通过这种方法检测的造血干细胞并不经常处于同一发育阶段。华侨大学生物技术系刘建福，40，HSC的研究不仅促进了造血理论研究的深入，还促进了血液学的发展。研究结果表明，很多再生障碍性贫血患者的HSC含量低于正常水平，并表明HSC数量减少和质量异常是再生障碍性贫血发病的重要因素。目前，HSC移植已成为治疗血液疾病的重要手段。根据HSC的来源，可以分为骨髓移植、外周干细胞移植、胚胎干细胞移植、肚脐HSC移植。骨髓里含有丰富的HSC，骨髓移植是治疗