克隆载体与表达载体

克隆载体基本性质基本特征（或载体的构建）原理机制常用的载体克隆载体质粒载体质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理）pSC101ColE1pBR322pUC18pUC19TA载体噬菌体载体噬菌体其DNA两端的5末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。(1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ 基因；基因 c 失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi 筛选（野生型 噬菌体在带有 P2 原噬菌体的溶源性 E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏感）1) 通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3) 外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5) 包装噬菌体颗粒的感染6)筛选（噬菌体载体的克隆原理）插入式载体置换型载体（取代型载体）M13噬菌体载体M13 噬菌体的基因组为单链 DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌基因间隔区（intergenic region, IG区） 基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，内含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。 IG区内只有一个 Bsu I 切点。（2）加入酶切位点，在IG区内加入单一内切酶位点。M13mp1 在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ（a-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大 但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。 （M13噬菌体产生单双链DNA的机制）M13mpn n代表系列数字 对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。 M13mp2：LacZ 5端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点噬菌体-质粒杂合载体黏粒载体考斯质粒是一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像l -DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。 cos 序列是 l 噬菌体 DNA 中将 DNA 包装到噬菌体颗粒中所需的 DNA 序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。设计构建的柯斯质粒一般长46kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。噬菌粒载体能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA重组操作简便，筛选容易 噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件)它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体1. 具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2. 编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择；3. 拷贝数含量高4. 存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNA分子8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.；在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNApUC118和pUC119人工染色体染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。 人工染色体载体拷贝数少，制备困难，通常采取“穿梭载体”的策略来解决含有质粒载体所必备的第一受体(大肠杆菌)质粒复制起始位点，这样的载体在大肠杆菌内可以按质粒复制形式进行高拷贝复制， 含有第二受体(如酵母)端粒(TEL)、DNA复制起始位点(ARS)和着丝粒(CEN)以及合适的选择标记。载体在体外与目的DNA重组后转化到第二受体细胞，按照染色体复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子一般采用抗生素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子常用与受体互补的营养缺陷型。酵母人工染色体载体YAC细菌人工染色体载体 BACP1噬菌体人工染色体载体PAC质粒载体总结质粒载体类型长度选择标记克隆位点pSC101天然质粒，属严紧型、低拷贝型9.09 kb四环素抗性Tetr7个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 、Sam I主要使用EcoR IColE1天然质粒，属松弛型多拷贝型6.3 kb大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫的基因（immE1）EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）pBR322元件来源 复制起点 orip MB1系列（来源于ColE1）的高拷贝型复制起点 Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。4363bp氨苄青霉素和四环素抗性24个克隆位点。其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。 pUC系列（i）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；（ii）氨苄青霉素抗性基因（ampr），但它不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点；（iii）大肠杆菌-半乳糖酶基因（lacZ）的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；（iv）位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它并不破坏该基因的功能2.7kbAmpicillin 抗性和 lacZ的 肽互补（蓝白斑）相结合。10个连续的单一限制酶切位点，位于lacZ基因的5端。TA载体耐热聚合酶可在PCR产物的3端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷(A)。根据这一特点研制出线性TA质粒载体，其5端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶(T)，用该载体可进行PCR产物的直接克隆。TA载体构建：在一般质粒载体的基础上构建。方法1：先采用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过K1enow片段将酶切的线性载体末端补平方法2：利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化钝末端质粒载体加T反应形成。目前有很多公司推出了TA质粒载体。噬菌体载体噬菌体载体分类插入式载体一种只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点的派生载体噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于cDNA文库或基因组文库的构建。 cI基因插入失活：如 gt10、NM1149等载体，在cI基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点。外源基因插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）置换型载体（取代型载体）具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA 片段所取代。野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段这些载体是用Lac 5 替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5 作为选择标记使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。置换型噬菌体是使用最广泛的载体。人工染色体类别元件优点酵母人工染色体载体YAC是最常用来克隆很大DNA片段（2Mb）的系统。为构建YAC需要结合四个短序列：即二个端粒、一个着丝粒和一个ARS元件，并将一适当大小的外源DNA连接成一线性DNA分子，而端粒序列位于正确的末端。 YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力细菌人工染色体载体 BAC是基于大肠杆菌的 F 质粒构建的，高通量低拷贝的质粒载体每个环状 DNA 分子中携带一个抗生素抗性标记，一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶（ （RepE） 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）以大肠杆菌为寄主，转化率高，构建BAC文库比YAC文库更容易；BAC载体以环型超螺旋状态存在，从大肠杆菌中提取质粒较方便，而从酵母中分离DNA较困难； BAC的复制子来源于F因子，可稳定遗传，嵌合及重组现象少；可以通过菌落原位杂交来筛选目的基因，方便快捷；BAC载体在克隆位点的两侧具有T7和Sp6聚合酶启动子，可以用于转录获得RNA探针或直接用于插入片段的末端测序。表达载体分类结构组成及表达元件特点或优点备注质粒表达载体原核表达载体1启动子、2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定性）3核糖体结合位点表达方式有：组成型表达，诱导型表达。 融合型表达， 分泌型表达。启动子类型：根据作用方式及功能分类组成型启动子组织特异启动子又称器官特异性启动子。诱导型启动子酵母表达载体来自pBR322基本骨架 含有该质粒复制起始位点(ori)，lacZ基因、bla或ampr、tetr等基因。含有URA3、HIS3、LEU2、TRPl、LYS2与特定的宿主营养缺陷突变体互补筛选或利用zeocin、basticidin（杀稻瘟菌素）的抗性基因筛选。启动子有GAP、AOXl、AUGl和GAL1等。 GAP是组成型启动子。其余是诱导型启动子。酵母表达载体多为穿梭载体：既可以在大肠杆菌中繁殖，获得足够的载体DNA进行体外操作，又可以在酵母中复制、表达和选择。融合蛋白表达载体：于外源基因插入位点的C端或N端插入了1个6His标签，或在5端插入了-因子作为分泌信号由于原核生物和真核生物存在糖基化、酰基化等翻译后修饰反应机制的差异，真核基因的原核表达难以获得有活性的蛋白。酵母成为真核表达的首选系统。Ti质粒表达载体一元载体 一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体(Ti质粒)通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连锁，也称为顺式载体(cis-vector)Ti质粒是根癌农杆菌中发现的可引发植物产生冠瘿瘤的质粒。根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类，Ti质粒可分为章鱼碱、农杆碱、农杆菌素和琥珀碱4种不同类型Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori 4个功能区。T-DNA区 是Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域。Vir区 位于T-DNA区的上游，其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域也称为致病区。Con区 该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因(tra)，这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。Ori区 调控Ti质粒的自我复制，为复制起始区构建的基本原理： 引入分子质量较小的中间载体，将欲转化的目的基因及抗性标记基因构建到中间载体上。 将Ti质粒上T-DNA的致瘤基因全部去掉，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25个碱基序列，构建成所谓卸甲载体。在卸甲载体的T-DNA区被删除致瘤基因位点插入中间载体同源的质粒序列，将中间载体转入含有卸甲载体的根癌农杆菌中，构建在中间载体上目的基因可通过同源重组整合到卸甲载体Ti质粒的T-DNA区，并与卸甲载体Ti质粒一起复制。二元载体 双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了TDNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的TDNA的转移。另一部份是微型Ti质粒，它在TDNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。 双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活TDNA 的转移。 与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制双元表达载体构件方便，转化效率高于一元载体。病毒表达载体杆状病毒表达载体杆状病毒表达系统的基本元件： (1)启动子：多个启动子同时表达多个外源基因。(2)poly A加尾信号： (3)同源重组序列。 (4)穿梭载体必需元件。除带有病毒自身的复制起始位点外，还带有pUC质粒的复制子及以ampr，可以在细菌内进行扩增。(5)筛选标记。重组蛋白具有完整的生物学功能：接近天然蛋白。能进行翻译后的加工修饰：研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面的理想模型。表达水平高：最高可使目的蛋白的量达到细胞总蛋白的50。能容纳大分子的插入片段：上限未知。能同时表达多个基因：在同一细胞内同时表达多个基因。能表达基因组DNA：昆虫杆状病毒表达系统具有剪切的功能。对重组蛋白进行定位的功能：如将核蛋白转送到细胞核上，膜蛋白则定位在膜上，分泌蛋白则可分泌到细胞外等。杆状病毒科病毒，杆状病毒颗粒，双链闭合环状DNA病毒，专一性感染无脊椎动物将外源基因先克隆到转移载体上，再与病毒基因组共同转染细胞，通过细胞内的同源重组获得带有外源基因的重组病毒的策略。 腺病毒载体腺病毒DNA末端结构突出特点 1）带有100bp反向的末端重复序列(ITR)，而且在每一条单链的5-末端还共价地连接着末端结合蛋白，对病毒的复制有重要作用。2）当它从病毒颗粒中分离出来之时，便会自发地环化起来，尔后许多环形分子又聚合成多聚体腺病毒载体是目前最为广泛应用的基因载体，也是唯一基因药物的载体双链DNA的分子大小约为36kb.可应用于1.基因治疗2.表达真核基因3.研制疫苗首先构建一个含多克隆位点和筛选标志的转移质粒，该质粒含有病毒基因组某段早期序列；然后将一个含有启动子一外源基因-poly A的表达盒插入到上述质粒中腺病毒E1、E3或E4至右侧的ITR区之间，构建成载有外源基因的穿梭质粒。反转录病毒载体泡沫病毒类从5端开始依次是：5长末端重复序列(5-LTR)，带有增强子和启动子序列；psi序列，又称序列，是病毒包装所必须的信号序列；gag，编码病毒衣壳蛋白；pol，编码反转录酶和整合酶(Int)；env，编码病毒颗粒外层包装蛋白；3长末端重复序列(3-LTR)，带有poly A加尾信号序列。一类含单链RNA的动物病毒。它的基因组含有2条相同的正链RNA分子，包装成二倍体病毒颗粒。（1）在大多数情况下，反转录病毒的肿瘤基因(onc)都能够在正常的细胞中转录。 2）反转录病毒的寄主范围相当广，包括无脊椎动物和脊椎动物。3）反转录病毒具有强启动子，外源基因可得到有效表达。4）反转录病毒不但感染效率高，而且不招致寄主细胞的死亡载体的构建:分离原病毒DNA删去部分序列组入选择性标记基因、目的基因和调控元件克隆到含有大肠杆菌复制起始位点的克隆载体转化大肠杆菌获得反转录病毒克隆载体 辅助细胞系(包装细胞系) 扩增慢病毒类致癌病毒类SV40病毒型转化载体根据SV40 DNA进入敏感动物细胞的转方向，分为早期转录区和晚期转录区。早期转录区包括与病毒感染相关的t抗原基因(small T-antigen)和T抗原基因(large T-antigen)等；含有BamHI等限制性内切核酸酶识别位点；晚期转录区包括与病毒壳蛋白合成相关的基因，含有EcoRi等限制性内切核酸酶识别位点。含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整