《分子遗传学》PPT课件

第四章转录（transcription）,2,3,基因表达(geneexpression)是指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。转录是基因表达的第一步，以dsDNA中的一条单链作为转录的模板，以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物，在依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolynerase,DDRP）的作用下，按AU，CG配对的原则，合成RNA分子的过程。,第一节基本概念,信使的发现,1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验：若加入RNA酶，则蛋白质合成就停止；若再加入从酵母的RNA，又可合成蛋白质。这表明什么？,同年Goldstein和Plaut同位素标记变形虫RNA前体：发现标记的RNA在核内标记追踪实验：经过一段时间发现被标记的RNA在细胞质中此表明什么？,1956年E.Volkin和L.Astrachan：用同位素脉冲一追踪标记：表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和T2的DNA碱基比相似，而和细菌的碱基比不同。由于T2感染细菌时注入的是DNA，而在细胞里合成的是RNA此表明什么？,最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman.SDNA-RNA的杂交实验：将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来，分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交，结果这种RNA只能和T2的DNA形成“杂种”链，而不能和E.coli的DNA进行杂交。,Jacob和Monod预言:（1）这种“信使”应是一个多核苷酸；（2）其分子平均不小于5105bp，足以携带一个基因的遗传信息；（3）它们至少是暂时连在核糖体上；（4）其碱基组成反映了DNA的序列；（5）它们能高速更新。Jacob和Monod将它定名为:信使RNA（MessengerRNA）或mRNA,一、RNA合成的基本特点,1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶（RNAPol）。几乎存在于所有细胞中，其特点是：（1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；（2）以DNA为模板；（3）按53方向合成；（4）无需引物的存在能单独起始链的合成；（5）第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在；（6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板；（7）RNA的序列和模板是互补的。,二、RNA合成和DNA复制的区别,（1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制时两条链都可作为模板；（2）转录时形成的DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放；而DNA复制叉形成后一直打开，新链和模板链形成聚合双链；（3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物；（4）转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP；（5）两者使用的聚合酶系不同。,三、有义链和无义链,1963J.Marmur和DotySpiegeman区分有义链，采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料；SP8DNA双链有“轻”、“重”，差异明显；现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链（templatestrand）或反义链（antisensestrand）；非模板链称为有义链（sensestrand）或编码链（codingstrand）；在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。,13,模板单链DNA的极性方向为35,而非模板单链DNA的极性方向与RNA链相同，均为53,DNA,(书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向),3-TACTCAT-5,RNA5-AUGAGUA-3,5-ATGAGTA-3,Non-template(sensestrand，编码链，与mRNA序列相同的那条链),template(antisensestrand，指根据碱基互补原则指导mRNA生物合成的DNA链),用实验证实mRNA的合成总是延着5-3方向进行的：E.coli在0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37C每秒就可加上40个核苷酸;利用这个差别以14C来标记U,在0C培养E.coli，提取这种正在伸长的mRNA分子发现14C标记首先出现在伸长的3端因此可以证明合成是延着5-3方向进行的,某一基因只以一条单链DNA为模板进行转录（不对称转录）,RNA转录包括promotion,elongation,termination三个过程,从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为转录单位（transcriptionalunit）,在DNA双链上，一条链可转录，另一条链不转录模板链并非永远在一条单链上,原核生物中的转录单位多为多顺反子，有操纵子结构；,转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值,真核生物中的转录单位多为单顺反子，无操纵子结构；,upstreamstartpointdownstream,启动子：指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域。,终止子：在转录过程中，提供转录终止信号的DNA序列,研究转录涉及到两个方面：其一是RNA合成的酶学反应；其二是RNA合成的起始、延伸、终止和释放各阶段；,第二节原核生物的转录,大肠杆菌的RNA聚合酶是目前了解最详细的RNA聚合酶在一个大肠杆菌细胞中，大约有7000个RNA聚合酶分子，其中有20005000个酶分子在参与RNA的合成RNA聚合酶合成RNA的速度：37约40个核苷酸/秒RNApol和DNApol有两点不同：（1）RNApol没有任何校对功能；（2）在不需要引物的前提下能起始合成新的RNA链。,一大肠杆菌的RNA聚合酶,大肠杆菌RNA聚合酶,CoreEnzyme核心酶,HoloEnzyme全酶480kDa,非专一性与DNA结合,专一性与DNA结合,全酶中的亚基与其他亚基结合较松弛，常易从全酶上解离,亚基的功能是识别和结合启动子的保守区，介导RNA聚合酶与启动子的结合。此外，新发现的一种亚基的功能尚不清楚。,E.coliRNAPolymerase,用于延伸,用于起始,36.5KD,36.5KD,151KD,155KD,11KD,70KD,21,因子,可重复使用(Reusable),使全酶识别SextamaBox(35区R位点)，并通过与模板链结合,修饰RNAPol构型,降低全酶与DNA的非专一性结合力（107/mol）,增强全酶与R,Bsite（-10区）的专一性结合力(1014/mol),启动因子,R位点-Sextama框，松弛结合位点B位点-Pribnow框(-10区)，紧密结合位点,因子（蛋白）包含一个螺旋-转角-螺旋结构，可以嵌入DNA大沟，并通过氢键与DNA紧密结合。,23,转录开始后，亚基脱离聚合酶，以后仅由核心酶催化RNA链的延长，否则RNA链的延伸缓慢不同的因子识别不同的启动子E.coli中有四种因子（70、32、54、28）枯草杆菌中有11种因子（通过因子的更替对转录起始进行调控）,枯草杆菌至少有10种因子：A，B，C，D，H，L：识别营养生长期表达的基因的启动子E，F，G，K：识别孢子形成期表达的基因的启动子,25,因子,促使RNAPol与DNA模板链结合,位于前端的因子使双链解链为单链,位于尾端的因子使单链重新聚合为双链,26,因子；,促进RNA聚合酶+NTP使RNA链延长,完成NMP之间的磷酸二酯键的连接,Editing（校正）,与终止蛋白Rho()因子竞争RNA3-end，决定转录是否终止,构成HoloEnzyme后，因子含有两个位点,对NTP非专一性结合,27,因子,强碱性亚基,与非模板链（sensestrand）结合（充当SSB）,受K酶抑制（K酶与终止有关，K酶结合后RNAPol从DNA上脱离，转录终止）,28,全酶含有五个功能位点,sensestrandDNAbindingpoint(),DNA/RNA杂合位点hybridsite(),dsDNA解链位点unwindingpoint(),dsDNA再缠绕位点rewindingpoint(),factorpoint,RNApol执行的功能,识别DNA双链上的启动子（promoter）；使DNA变性，在启动子处解旋成单链；通过阅读启动子序列，RNApol确定它自己的转录方向和模板链；最后当它达到终止子时，通过识别终止序列停止转录。,二、转录的起始与延伸,(一)启动子的结构和功能启动子（promoter）：是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域，它还包括一些调节蛋白质因子的结合位点。位于基因5端的调控区域，启动转录的起始。启动子是控制转录起始的序列，并决定某一基因的表达强度；与RNA聚合酶亲和力高的启动子，其转录起始频率和效率均高；启动子的DNA序列有其独特的特点，原核生物和真核生物的启动子序列结构上有一定差异。,34,promoter由两个重要部分组成(扩展的启动子),上游部分CAP-cAMP结合位点-70-40,下游部分RNAPol的进入（结合）位点-35-10+1,基因表达调控的正控制位点,上游控制因子UCE,upstreamcontrolelement,核心启动子，corepromoter,CAP-cAMPbindingsite,siteI+CAP-cAMP,cooperativeeffect,提高siteII的结合效率,1.上游控制因子的结构特点,SiteII+CAP-cAMP复合体促使SextamaBox附近GC岛区的双螺旋结构稳定性降低，PribnowBox的解链温度降低，利于转录启动,RNAPol,37,(1)结构典型,都含识别（R，即-35区),结合（B，即-10区)和起始（I，+1）位点;(2)序列保守;如-35和-10序列结构；(3)位置和距离都比较恒定；(4)直接和多聚酶相结合；(5)位于基因的上游；(6)决定转录的启动和方向；(7)常和邻近基因共同组成操纵子（operon），这也是原核生物的特性。,2.核心启动子序列的结构特点：,典型启动子的结构,-35区-10区转录起点+1TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp,40,-35区（Sextama框）是RNAPol的松弛（初始）结合位点因子可以识别该位点，所以称作recognitionsite(Rsite)保守序列为TTGACA，每个碱基的出现频率不同，又可写为T82T84G78A65C54A45功能是:（1）为RNApol的识别位点。亚基识别-35序列，为转录选择模板，很大程度上决定了启动子的强度；（2）-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNApol的结构有关。位置在启动子中略有变动,-10区（Pribnow框）,-10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故称为Pribnow框（Pribnowbox），它位于转录起点上游约-10bp处，是RNApol的牢固结合位点bindingsite(Bsite)。保守序列为TATAAT，每个碱基的出现频率不同，又可写为T80A95T45A60A50T96;位置范围-4到-13，AT较丰富，易于解链。其功能是：(1)RNApol紧密结合位点;(2)在此形成开放启动子复合体；(3)使RNApol定向转录。,-10序列的碱基组成对转录的效率影响很大，发生此区域的某些突变会导致如下结果：,减效突变：TATAATAATAAT，转录效率会下降，即称减效突变（downmutation）。增效突变：TATGTTTATATT，则转录效率会上升，即称增效突变（upmutation）。前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少。,转录开始时模板上的第一个碱基为转录起始位点；在原核生物中90%以上为A或G；位置固定，常见序列是CAT。,转录起始点（initiationsite）：+1位点,44,lSextamaBox与PribnowBox间距17bp,有利于RNAPol启动,lSextamaBoxorPribnowBoxmut.,间距趋近于17bp，upmutation,间距远离于17bp，downmutation,17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要,SextamaBoxandPribnowBoxmut.,转录率下降100X,转录率下降1000X,*-35和-10都是大致位点,46,47,因子起着识别启动子的作用；,在菌体细胞中，只有很少的RNA聚合酶分子（核心酶）呈游离状态，大部分与DNA分子结合存在。这种结合为松弛型结合，形成松弛型复合物，并且核心酶对启动子无特殊的亲和力；,全酶形成后，对启动子的亲和力大大提高，转录酶沿DNA滑行至启动子，由因子识别并紧密结合，形成紧密闭合型复合物；,（二）转录的起始,48,49,在开放型启动子起始复合物中，RNA聚合酶移动到转录起点I，酶上的起始位点和延伸位点被相应的核苷酸占据，在亚基的催化下形成第一个磷酸二酯键，从而形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternarycomplex）转录开始，当RNA合成至长约9核苷酸时，因子解离下来，形成延伸复合物，此时核心酶约与55bp（3520）的DNA相互接触。,50,（三）RNA的合成延伸,在酶分子上有两个核苷酸结合位点，一是起始位点，一是延伸位点；当两个位点都与模板互补的核苷酸结合后，第一磷酸二酯键才能形成；随着RNA聚合酶沿着模板链的滑动，由亚基催化合成RNA链；延伸方向为5-3。,转录过程,转录酶沿编码链53方向移动，开放复合体（保持约17bp长）随之前移，RNA链以53方向合成延伸，速度约为43核苷酸/秒。,三、转录的终止,在开放复合体中，RNA与DNA的氢键结合能够防止转录酶脱离DNA。当RNA-DNA杂交区被迫分离时，则转录酶和RNA均脱离DNA，转录结束。终止子（terminator,t）：在转录过程中，提供转录终止信号的序列，按终止方式不同分为强终止子和弱终止子。强终止子：内部终止子（intrinsicterminators）或称自发终止；弱终止子：需要因子（rhofactor）又称为依赖性终止子（rho-dependentterminator）。,自发终止在RNA链中需要两种序列元件：位于RNA3末端的富含U的序列，即U串；靠近RNA3末端的自互补序列（即回文序列），可形成茎-环结构。,茎-环结构使转录酶停止合成RNA。接着由于U-A间氢键较弱，故而RNA自行脱离DNA，从而终止转录。,强终止子的结构,NNAAGCGCCGNNNCCGGCGCTTTTTTNNNNNTTCGCGGCNNNGGCCGCGAAAAAANNNDNANNAAGCGCCGNNNCCGGCGCUUUUUUNNNRNA,NNNNNGCCGCGGCCGGCCUNNNNCUUUUU-OH3mRNA强终止子结构的模式图,发夹结构,强终止子的结构特点：,(1)有回文结构存在；(2)茎的区域内富含G-C；(3)强终止子3端上有连续6个U。终止机制：*终止作用发生在RNA水平上,形成的颈环空间结构阻止了转录的进行,同时3端上连续6个U使RNA易解离,脱离DNA模板,于是整个mRNA释放出来,转录停止。,依赖于因子的终止大肠杆菌中的因子为碱性蛋白，分子量为46kDa，有解旋酶功能。因子识别RNA上的rut位点，与之结合，然后向转录酶移动。当转录酶到达终止序列时，则停止合成RNA，于是因子赶上转录酶，使RNA-DNA杂交链解开，从而RNA和转录酶脱离，转录结束。,含有IR序列，也能形成发夹结构；C的含量多，G的含量少；缺少U串；*RNA聚合酶在此处暂停，若加入因子，则使转录停止在特定的终止位点。,依赖性终止子结构与终止机制,*因子可识别终止位点上游5090bp的区域，该区域RNA分子中C的含量高，G的含量少。,RNAPol转录DNA因子附着到RNA识别位点上因子跟在RNAPol后沿RNA移动RNAPol在终止位点停下，并被因子追上在转录泡中因子使DNA-RNA杂种双链解开转录终止,释放出RNAPol,子和RNA,野生型突变型核糖体结合到mRNA上核糖体阻碍核糖体在突了因子的变位点解离附着和移动因子附着因子和RNA核糖体阻碍聚合酶接触因子移动转录继续转录提前终止,第三节真核生物的转录,真核生物的转录和原核转录的不同点：原核只有一种RNA聚合酶，而真核细胞有三种聚合酶；启动子的结构特点有所不同，原核生物启动子结构类似，真核有三种不同的启动子和有关的元件，分别对应不同的RNA聚合酶；真核的转录有很多蛋白质因子的介入。,表12-2真核生物的三种RNA聚合酶的特点RNAPol位置产物相对活性对-鹅膏蕈的敏Pol核仁28s,18s,5.8srRNAs5070%不敏感Pol核质hnRNA,mRNA,某些SnRNA2040%高度敏感Pol核质tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs10%片段特异，中等敏感表12-3转录的抑制剂抑制剂靶酶抑制作用利福霉素细菌全酶和亚基结合，抑制起始链霉溶菌素细菌核心酶和亚基结合，抑制起始放射线素D真核Pol和DNA结合，阻止延伸-鹅膏蕈真核Pol和RNAPol结合,一、真核的RNA聚合酶,真核生物有三种转录酶：转录酶I：转录rRNA（5SrRNA除外）转录酶II：转录所有mRNA及某些snRNA转录酶III：转录所有tRNA及5SrRNA和几种小分子RNA三种转录酶都含有约10个亚基，其中2个大亚基与细菌转录酶的和亚基相似，起催化RNA合成的作用。真核生物转录酶全酶不包括转录因子，但须有转录因子才能起始转录。,二、启动子,真核生物的三种转录酶对应有三种启动子，它们通常包含一个核心启动子和一些调控元件。,转录酶I的启动子不同生物的转录酶I启动子没有序列同源性，但位置相对一致。45SrRNA是串联重复的冗余基因（18S+5.8S+28S），在基因内和间隔区都有启动子，因此可以转录出两种产物。,转录酶II的启动子起始区中转录起点通常为A，其上游为2个嘧啶及C，下游为5个嘧啶；TATA盒负责精确定位转录起点。GC盒（GGGCGG）和CAAT盒（GGCCAATCT）为转录因子识别位点，将转录酶吸引到启动子附近，其数量和位置因基因不同可有很大变化。,转录酶III的启动子A、B、C盒皆为长约10bp的序列，协助转录酶III与DNA结合。,三、转录因子,在真核生物中已发现一些通用的转录因子：转录酶I的转录因子上游结合因子（UBF）SL1因子：由TATA结合蛋白（TBP）和TATA结合蛋白联结因子（TAF）组成,转录酶II的转录因子已知作用于TATA盒的转录因子II主要有6种，从酵母到人类均是保守的：TFIIA：使TFIID与TATA盒结合更紧密，故非必需。TFIIB：将转录酶II引进起始复合体。TFIID：识别TATA盒，主要成分是TBP和TAF。TFIIE：促进TFIIH激酶活性，反控其的解旋酶活性。TFIIF：促进转录酶II进入起始复合体，与转录酶II结合后有解旋酶活性，为开放复合体形成所必需。TFIIH：对由闭合复合体转向开放复合体起作用，使转录酶II脱离起始复合体，进入延伸状态。,转录酶III的转录因子已知转录因子III有3种：TFIIIA：识别BoxA和BoxC，启动5SrRNA的转录。TFIIIC：识别BoxA和BoxB，启动tRNA的转录。TFIIIB：含有TBP，与TFIIIA-5SrDNA复合体及TFIIIC-tDNA复合体发生作用，然后使转录起点上游的DNA弯曲，将转录酶III定位于转录起点，激活转录。,TBP在转录起始中的作用,I类TAFI类起始因子+转录酶II类转录SL1复合体rRNAII类TAFII类起始因子+转录酶IIII类转录TBPTFIID复合体mRNAIII类TAFIII类起始因子+转录酶IIIIII类转录TFIIIB复合体tRNA,真核生物细胞中有三种转录方式，分别由三种RNA聚合酶（、和）催化，与之相对应有三种启动子：RNA聚合酶启动子-类基因RNA聚合酶启动子-类基因RNA聚合酶启动子-类基因重点介绍RNA聚合酶催化的mRNA的转录,四、真核生物转录的起始,1.RNA聚合酶启动子,启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同：（1）有多种元件：TATA框，GC框，CAAT框等；（2）结构不恒定；（3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同；（4）有的存在远距离的调控元件，如增强子；（5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；（6）不直接和RNApol结合；(7)需多种转录因子介入。,类基因的启动子和调控区,TATA框：转录起始点上游-30处，又称Hogness框。核心元件起始子（initiator，Inr）：一般由Py2CAPy5构成，位于-3+5，可能提供RNApol识别。CAATbox：转录起始点上游-75处。类启动子上游元件组成GCbox：转录起始点上游-90处。增强子（enhancer）远端调控区减弱子（dehancer）静息子（sisencer）上游激活序列（upstreamactivatingseguencesUASs）,起始子（initiator，Inr）,起始点一般没有同源序列;mRNA的第一个碱基倾向A，包括A在内的两侧翼由Py组成称为起始子（initiator,Inr)。在原核CAT起始序列也有这种情况）;一般由Py2CAPy5构成;位于3+5处；提供RNApol识别；无论TATA是否存在，Inr起始子的强度和起始位点的选择都很重要；现已纯化了Inr结合蛋白。,TATAbox,TATA框又称Hogness框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖（Goldbrick）。其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50；常在30区左右，相当于原核的10序列。其作用是：(1)选择正确的转录起始位点，保证精确起始，故也称为选择子（selector）。(2)影响转录的速率。,上游启动子元件（UPE）,表12-4哺乳动物RNAPol上游转录因子结合的元件元件保守序列结合DNA的长度蛋白质因子T