影响凯氏定氮法测定粗蛋白准确性应注意的细节问题

国标为0.4g硫酸铜和6g无水硫酸钾(或无水硫酸钠)，比例为1:12。若添加量加大，消化液易结块不易转移；添加量减少，消化时间加长或者消化不完全。3.2 硫酸的用量浓硫酸的用量应视试样的重量、含水量及其所含蛋白高低而适当调整。对于体积大重量轻的粗饲料、高蛋白饲料或者含水量较高的试样、淀粉含量多的精料,应适当加大浓硫酸的用量，多为15ml左右。这是由于此类样品，浓硫酸在对其脱水和碳化是消耗量加大，当加入的浓硫酸量不足或者刚刚够试样脱水和碳化时就会出现烧干现象。反之则需加入10ml左右。若通风柜的排风量较大时应适当多加浓硫酸2ml左右，以防止浓硫酸的蒸发而是其浓度降低，试样消化不完全从而导致所测得的数值偏低。3.3 消化温度刚开始时以低温(200300)加热，待试样焦化泡沫消失后，逐步缓慢提高温度(360410)。起初低温加热是为防止试样起泡沫，而溢出烧瓶外或碳化后的颗粒粘附于烧瓶壁，导致消化不完全，所测结果偏低。对于富含脂肪或者在消化过程中易发泡的样品，可在消化前滴加少量消泡剂，如辛醇、液体石蜡等。3.4 消化时间消化时间也是许多文献一直在探讨的问题，也有许多快速消化法的研究。其消化时间的标准为消化呈透明蓝绿色后，再加热消化15min。根据苏军等研究表明，消化液澄清后再继续消化30min为宜。此试验只是针对于蛋白含量低于蚕蛹的样品，而对于蛋白含量高于蚕蛹的样品，如进口鱼粉、血粉、羽毛粉等并未进行试验性研究。因此我个人认为，可根据试样的重量、蛋白含量的多少以及消化的难易程度而适当调整消化液澄清后的消化时间。对于所称试样质量较多、蛋白含量高于蚕蛹或者难消化的试样，消化液澄清后继续消化的时间可控制在45min2h不等，具体时间化验工作者可根据自己的工作经验而自行定夺。3.5 消化液的转移及定容消化结束后，把凯氏烧瓶从电炉上取下，放在小铁筐内冷却。此时一定要注意安全，带稍厚手套防止烫伤。冷却至室温后加入蒸馏水1020ml，在等冷却至室温后转移到100ml容量瓶内。在转移是为减少损失误差，应在容量瓶口上加上漏斗，且要用少量蒸馏水多次洗涤烧瓶和漏斗(即采用少量多次原则)，否则会因偶然误差而导致测定结果偏低。转移完成后不要立即定容，应冷却至室温后再定容。若未冷却而定容，待冷却后，体积缩小，从而使吸取的试样分解液的量偏大，测定结果将偏高。若消化完毕冷却后，消化液不能当天定容需隔夜保存时，应先将凯氏烧瓶内加入少量的蒸馏水，防止消化液结晶，再把凯氏烧瓶口用塑料布包好，防止吸收空气中的氨而影响结果的准确性。消化液若结晶不易转移时，可将凯氏烧瓶放在电炉上加热一下，待结晶融化后再转移。 4 蒸馏4.1 蒸汽发生器内水的体积及酸碱性蒸汽发生器内的水的体积应控制在其容积的2/3左右，并控制液面高度。水的体积过大易在沸腾后从蒸汽发生器中玻璃管中溢出烫伤工作人员；过少易产生的气体压力不足或蒸干蒸汽发生器发生事故。水加入的同时一同加入几滴硫酸和几滴混合指示剂，且保持水一直呈紫红色，以防止水中含有氨态的氮溢出而影响测定值。4.2 蒸馏装置的气密性在蒸馏操作开始前一定要检查一下蒸馏装置的气密性。各导管的接口及用久的橡皮管应重点检查。添加消化液和碱液的玻杯口要拧紧、液封，防止产生的氨气逸出。在检查气密性的同时还应打开冷凝水开关且要保持一定的流速，否则冷却不完全。这是很容易忽视的问题，特别是初学者。4.3 试样分解液的移取要准确在移取试样分解液前先把容量瓶摇匀,把10ml移液管用所以取得试样分解液润洗23次后，再进行移取。移取时移液管应垂直于地面，视线与移液管刻度线平行。吸取完试样液后把移液管放到反应室内自然流入反应室，切忌把移液管放到小玻杯内及用吸耳球吹移液管。最后再用少量蒸馏水冲洗一下小玻杯，并把棒状玻塞塞紧。4.4 氢氧化钠溶液的加入量在蒸馏过程中，反应室内溶液应保持碱性，碱的加入量一般为10ml左右，若在消化时所加入的硫酸偏多，40%氢氧化钠溶液的量也要随之增加，这样才能保证除用于和硫酸及硫酸铜反应外，还有足以使氨根转化为氨的碱量。加入的碱先放入小玻杯内，慢慢转动棒状玻塞，使碱缓慢流到反应室内，然后再将小玻杯内加入蒸馏水液封，切忌把棒状玻塞提起加碱特别是初学者，这样会造成反应后生成的氨从玻口逸出，导致所测蛋白含量偏低。4.5 蒸馏速度与气流蒸馏时产生的气流一定要均匀，切忌热力不稳、中途中断或蒸汽不足，否则反应室内温度会降低，易产生倒吸；气流过快硼酸吸收不完全。蒸馏的速度除与气流有关外还与冷却水的流速及电路的温度有关。蒸馏速度快，反应液易被蒸汽带出而使测定结果偏高；蒸馏速度慢，氨没有被完全蒸馏出来而结果偏低。那么以什么样的蒸馏速度为宜呢？据贾艳玲和冷柏忠(2000)实践证明：蒸馏速度一般应控制在每分钟蒸馏出液体在57ml之间。4.6 蒸馏时间蒸馏时间多为5min，加入试样分解液及氢氧化钠后蒸馏4min,使冷凝管末端离开硼酸液面后再蒸馏1min。但是标准中并未规定从何时开始计时，据谢文飞(2003)的实验证明，在蒸馏完4分钟后再多蒸馏12min对结果没有什么影响，所以可以从硼酸刚刚出现绿色时开始计时蒸馏4min(硼酸出现绿色说明反映已经开始)。最终在4分钟后是否蒸馏完全可用PH试纸进行检测。在蒸馏时还应注意硼酸的吸收温度。硼酸是极弱的酸，只起吸收氨的作用，但要注意硼酸吸收液温度不应超过40，否则氨的吸收减弱导致结果偏低。4.7 反应室的冷却与洗涤首先在蒸馏完毕，将冷凝管末端用蒸馏水冲洗后，再将锥形瓶移开进行滴定。清洗反应室时严禁将蒸馏瓶两侧的阀门同时关闭，以免发生爆炸。反应室清洗一定要彻底，一是防止残留液影响下次测定结果的正确性；二是给反应室降温。如果反应室温度很高，再加之加入的氢氧化钠与硫酸反应放出的大量热，易产生爆沸，将反应液冲入冷凝管，造成实验失败。另外反应室温度高，反应剧烈，有部分氨硼酸吸收不完全而逸出，测得的结果将偏低。一般反应室温度降至不烫手即可。4.8 锥形瓶的预处理锥形瓶往往用洗衣粉洗涤，再用自来水、蒸馏水冲洗。洗衣粉不易彻底冲洗干净，导致锥形瓶内壁环境偏于碱性；另外各地自来水的PH不同，所制的蒸馏水PH有时也会偏离中性，这样都会导致测定结果出现偏差。建议把锥形瓶进行预处理后再使用，其方法为：冲洗干净的锥形瓶加入20ml蒸馏水、2滴混合指示剂，再用0.02molL-1的盐酸溶液或者0.02molL-1的氢氧化钠溶液滴定至刚好由蓝色变为灰红色，然后倒掉该液体后，再加硼酸吸收液2535ml和混合指示剂23滴。若加入指示剂后硼酸为蓝色，则说明硼酸中混入碱性物质或蒸馏水偏碱性，需重新配制硼酸溶液。锥形瓶的预处理虽然比较繁琐，但是可减少由于锥形瓶本身环境的PH偏离中性对测定结果的影响。4.9 滴定滴定是整个实验过程的最后一步，至关重要，否则整个实验将前功尽弃。滴定前把盐酸标液瓶摇匀后，把酸式滴定管润洗23次后加入盐酸标液排除气泡，记下刻度值，开始滴定。滴定时一定要控制好滴定速度，待接收液由浅绿色逐渐变成无色时要放慢滴定速度，逐滴加入盐酸标液，接收液变成浅红色时为滴定终点，切勿滴过量。5 空白测定5.1 试剂空白测定另取凯氏烧瓶或者消化管一个，加入硫酸铜、无水硫酸钾(或无水硫酸钠)、浓硫酸，其中每个药品的加入量与试样消化时的加入量相同，加热消化至溶液呈透明的蓝绿色。其后的操作步骤完全相同。这样可以较正试剂不纯所发生的误差。5.2 试样空白测定称取0.5g分析纯蔗糖代替试样，以后各种试剂的用量及操作步骤完全相同。其标准为，空白测定消耗0.1molL-1盐酸标液体积不超过0.2ml；消耗0.02molL-1盐酸标液体积不超过0.3ml。以上两个空白测定并不需要每次都要做，隔一段时间操作一次即可，但是在更换药品试剂、标准溶液时一定要做空白实验测定。若空白值超标，一般是由于所用试剂级别不够或不纯、蒸馏水不纯、玻璃器皿清洗不干净等原因造成。 6 蒸馏装置及操作准确性检测在进行样品检测的同时，精确称取0.2000g分析纯的硫酸铵代替试样，直接定容100ml后进行蒸馏、滴定，测得硫酸铵含氮量为21.19%0.2%，以校正蒸馏装置的气密性和加碱、蒸馏和滴定各步骤是否正确。7 计算时换算系数的处理我们在计算蛋白含量时多乘以平均系数6.25，对于粗蛋白质中含氮量尚未确定的可以乘以平均系数，对于已经确定的则不妥，以豆粕为例：如果测定豆粕和以豆粕为主要原料的浓缩饲料的粗蛋白质含量时，用6.25作为蛋白质的换算系数的话，比大豆的实际换算系数5.70扩大了0.54倍，相对误差将在8%左右，因此对于已经确定的换算系数就用实际系数来换算，例如荞麦、玉米用系数6.00，大豆、豌豆、蚕豆、燕麦、小麦、黑麦、箭舌草等用系数5.70，黄豆用系数5.71，大麦用系数5.83，棉籽、芝麻、葵花籽用系数5.30，花生用系数5.46，全脂大豆粉用系数5.72，牛奶用系数6.38。以上是本人用凯氏定氮法测定饲料中蛋白质含量的一些体会、经验，与大家共同探讨。参考文献：01张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术(第2版)M.北京：中国农业大学出版 社,2003.02李玫等.影响凯氏定氮准确性的因素J.中国饲料,2003（9）:25.03韩国.提高饲料粗蛋白测定的准确度J.黑龙江畜牧兽医,2003（4）:2223.04安国民等.测定饲料中粗蛋白质含量应注意的几个问题J.粮食与饮料工业, 2006(5）:42.05舒畅.影响饲料中粗蛋白检验准确性的几个环节J.河南畜牧兽医,2002,23（11）:27.06邢雅静,张胜利.粗蛋白测定在实际操作中应注意的问题J.河北畜牧兽医, 2003,19(5):49.07李峰,张忠远.饲料常规成分检测中应注意的问题J.饲料工业,2006,27(23):3336.08聂青平,李健.饲料样品处理对粗蛋白测定值的影响J.广东饲料,1995(3):4142.09刘庆华,等.粉碎力度对粗蛋白测定结果的影响J.饲料研究,2007（7）:2224.10谢文飞.凯氏定氮法测定饲料粗蛋白的注意细节J.饲料广角,2003（14）:1718.11曹雨莉,等.饲料样品粗蛋白质测定过程中应注意的几个问题J.中国牛业科学,2007， 33（7）:4344.12俞玉忠,等.消化时间对总氮测定结果的影响J.海峡药学,2004,16（3）:7980.13苏军,等.蛋白质测定中消化液澄清