常用分子生物学技术的原理及应用

.,第二十二章,常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication,.,第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology,.,核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。,一、分子杂交与印迹技术的原理,.,复性,RNA,DNA,.,（一）印迹技术（二）探针技术,探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。,.,二、印迹技术的类别及应用,（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。,（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。,（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。,.,其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip),.,三种印迹技术的比较,目录,放射自显影照片,目录,.,DNA点阵,目录,.,第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction,5,Primer1,5,Primer2,5,5,TemplateDNA,一、基本工作原理,目录,目录,.,模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+,二、PCR体系基本组成成分,.,三、PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,.,（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析,四、PCR的主要用途,.,三、几种重要的PCR衍生技术,（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术,实时PCR技术原理,目录,.,第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis,.,核酸序列分析的基本原理,化学裂解法(Maxam-Gillbert法),DNA链的末端合成终止法(sanger法),.,一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法),基本原理,基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。,.,二、DNA链末端合成终止法,.,目录,.,三、DNA自动测序,采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。,.,DNA自动测序结果举例,目录,.,基因文库GeneLibrary,第四节,.,基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary),基因文库(genelibrary),是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。,.,目录,.,第一轮筛选,第二轮筛选,第三轮筛选,基因组文库筛选结果举例,.,疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes,第五节,.,克隆疾病相关基因的策略,（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches),.,定义从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。,（一）功能性克隆,应用生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。,.,克隆方式利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。,功能互补试验(functionalcomplementationassay)利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。,.,（二）定位克隆,定义从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩小范围，最后克隆该基因。,系统的定位克隆工作遗传学分析(确定致病基因染色体定位)交换分析、连锁不平衡分析分子生物学分析染色体异常(缺失、易位等)分析、基因文库的筛选与基因克隆,.,（三）非定位候选基因克隆策略,由于基因组作图的完成和分子病理学的发展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测出候选致病基因。,.,（四）定位候选基因克隆策略,当致病基因的染色体定位确认后，人们可以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数据，鉴定出候选致病基因。,.,第六节遗传修饰动物模型的建立及应用,TheEstablishmentandApplicationofHeredity-ModifiedAnimalModel,.,转基因技术采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子宫，使之发育成个体。,转基因被导入的目的基因转基因动物(transgenicanimal)目的基因的受体动物,一、转基因技术,.,核转移技术即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即克隆(clone)。,二、核转移技术,目录,.,基因剔除技术也称基因靶向(genetargeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。,三、基因剔除技术,.,四、基因转移和基因剔除技术在医学中的应用,建立动物模型单基因决定疾病模型基因剔除获得性突变(gain-of-functionmutation)多基因决定疾病模型,.,第七节生物芯片技术,BiologicalChipTechnology,.,DNA芯片(DNAchip)cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。,一、基因芯片(genechip),.,目录,.,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质芯片(proteinchip),.,第八节蛋白质相互作用研究技术,ResearchTechnologyofInteractionofProtein,.,蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。,蛋白质之间相互作用研究的重要性,.,酵母双