临床酶学检验的原理和方法

第二十三章 临床酶学检验的原理和方法,第2页,教学目标与要求,掌握,定时法和连续监测法的概念和特点；酶活性测定最适条件及其确定；影响酶活性测定的主要方法因素。,熟悉,酶活性测定的意义；定时法和连续监测法酶活性浓度的计算；最适底物的选择和浓度确定。,了解,酶促反应进程曲线；影响酶活性测定各因素的作用机制；酶活性的校准物和计算K值；同工酶测定方法和意义。,第3页,主要内容,第4页,基本特点,1.项目多，应用广,基本方法,临床酶学检验,2.含量少，难度大,3.高灵敏度,4.高特异度,1.活性测定法,2.质量测定法,第5页,酶促反应进程,一,二,三,第一节 酶活性测定的理论基础,定时法（Fixed time assay）,连续监测法（Continuous monitoring assay）,第6页,一、酶促反应进程,酶促反应动力学参数1.初速度(initial velocity)指在反应最初阶段底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度，用v0来表示2.最大反应速度(maximum velocity)指当酶的结合位点与底物结合饱和时的反应速度，通常用V或Vmax来表示 3.米氏常数（Michaelis constant，Km）指酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位同底物浓度,酶促反应进程曲线,如将酶反应过程中测得的产物P或底物S变化量对时间作图，可得酶促反应时间进程曲线。图中产物P或底物S变化曲线的斜率就代表酶促反应的速率。,延滞期,线性反应期,底物耗尽期,必须根据线性反应期的反应速率才能准确计算出酶活性浓度。,第8页,酶促反应,*诱导契合假说(induced-fit hypothesis),酶底物复合物,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。,第9页,目 录,第10页,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,目 录,第11页,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,目 录,第12页,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应,目 录,第13页,延滞期lag phase线性linear phase非线性期non-linear phase,酶促反应时间进程分期,第14页,酶促反应进程中的反应级数,零级反应一级反应,第15页,IFCC推荐法测定ALT的时间进程曲线,第16页,二、定时法,酶活性浓度测定方法酶活性浓度：用反应速度反映酶浓度E，要求酶促反应的初速度（v）达到最大速度Vmax，此时两者之间存在线性关系。按反应时间分类：定时法和连续监测法按检测方法分类：量气法、分光光度法、荧光法、 放射性核素法、离子选择电极法，旋光法、极谱法、HPLC或生物发光法等。,按检测方法分类底物或产物浓度的检测,第18页,（一）概念,将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ min便是以国际单位表示的酶活性。,第19页,主要优点 设备简单，操作方便，检测过程中无需恒温设备，用分光光度计即可测定，也不用考虑显色剂对酶活性的影响，是早期常用方法。主要缺点 确定选定的反应时间是否处于线性期。,（二）特点,第20页,（三）计算,第21页,酶活性浓度的计算公式,摩尔吸光系数 和系数 K 均为常数， 和 K受仪器诸多因素的影响，如波长的准确性、半波宽的大小、比色池光径及磨损与清洁度、温控的准确性、加样系统状况等。 和 K 可用校准物定期校正。,第22页,分光光度计,光源,单色器,吸收池,检测器,显示,I0,参比,第23页,朗伯-比耳定律的推导 朗伯(Lambert)和比耳(beer)分别于1760年和1852年研究了光的吸收与有色溶液按层的厚度及溶液浓度的定量关系，奠定了分光光度分析法的理论基础。当一束平行单色光照射到任何均匀、非散射的介质（固体、液体或气体），例如溶液时，光的一部分被介质吸收，一部分透过溶液、一部分被器皿的表面反射。如果入射光的强度为I0，吸收光的强度为Ia，透过光的强度为It,反射光的强度为Ir则它们之间的关系为 I0Ir+Ia+It,1. 朗伯-比耳定律,第24页,二者的结合称为朗伯比耳定律：,A=lg(I0/It)=kbc,朗伯定律:(1760) A=lg(I0/It)=k1b 当入射光的 ,吸光物质的c 一定时,溶液的吸光度A与液层厚度b成正比.,比尔定律(1852) A=lg(I0/It)=k2c 当入射光的 ,液层厚度b 一定时,溶液的吸光 度A与吸光物质的c成正比.,1. 朗伯-比耳定律,第25页,2. 吸光系数 Absorptivity,b ：吸光液层的厚度，光程， cm,c：吸光物质的浓度， g / L, mol / L,K：比例常数,入射光波长,物质的性质,温度,取值与浓度的单位相关,c：mol / L,K ,摩尔吸光系数， L mol 1 cm -1,Molar Absorptivity,摩尔吸收系数在数值上等于浓度为1 mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度,第26页,是吸光物质在一定波长和物质中的特征常数，反映该吸光物质的灵敏度。值越大，表示该吸光物质对此波长光的吸收能力越强，显色反应越灵敏，在最大吸收波长处的摩尔吸光系数常以max表示；,的含义,第27页,3.2 校准物,可用作酶活性测定用的校准物分两类。一类是产物的基准物质，如对硝基酚、对硝基苯胺等，用于校准仪器的 值（摩尔吸光系数）。另一类称酶校准物（Enzyme calibrator），多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近，用于校准仪器的 K 值（酶活性浓度定量系数）。,第28页,3.2 校准物,国际上已经有经IFCC认可的CRM酶参考物。各试剂供应商所提供的酶校正物的定值应可溯源至CRM酶参考物。常规工作一般选用用于常规实验室的工作校准品。目前，临床常规实验室应用较多的是德国宝灵曼公司的校准品(c.f.a.s)。,第29页,3.3 的校准（340 nm波长）,NAD(P)H是酶活性测定中常用的指示辅酶。在340nm的NAD(P)H的，可用葡萄糖己糖激酶法实测、计算其实测的。NAD(P)H的为6220。如果6 0006600为不合格，则需找维修部检查。注：干涉滤光片者需校准，光栅式可直接使用文献或试剂盒说明书的数值。,第30页,3.3 的校准（405 nm波长）,最常用的色素原为对硝基苯酚等。对硝基苯酚在405 nm的，可用ALP测定试剂的缓冲液作为测定试剂，对硝基苯酚标准液作为血清标本，实际测定计算值。对硝基苯酚的为18700。如果值偏差过大，则需找维修部检查。,第31页,3.4 K的校准（酶校准物）,使用公认的酶校准物对K值进行校准，它是国际上目前酶测定标准化新途径。使用酶校准物的优点，除具有实测值换算出的校准K值所具有的一切优点外，还可促进方法间的一致性和增加常规酶方法的可靠性，可使不同实验室之间的测定结果相对统一。,第32页,3.4 K的校准（频率）,最好（低）每半年进行一次酶活性的校准。仪器在使用过程中，滤光片、加样系统的精度都可能发生变化，光学系统的灯泡、光电转换元件的老化、灵敏度变化等，都会导致测定结果的偏差。但日常工作中，遇到下列情况时，必须进行校准：试剂盒改变厂家，或者更换了批号；仪器性能改变，如进行一次大的预防性维护或者更换了重要部件；质控反映出异常的趋势或偏移，或者超出实验室规定的接受限，采取一般性纠正措施后，不能识别和纠正问题时。,定时法,无机P,酚,氨,萘胺,NAD(P)H,H2O2,丙酮酸,淀粉,ALT、AST、LD,ALP、ACP、5NT,ALP、ACP,ADA、脲酶,CK、GGT,LD、GLD、G6PD,ALT,AMS,（四）方法设计,显色物,项目,第34页,（一）概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。,三、连续监测法,第35页,第36页,第37页,主要优点 勿须终止酶促反应，不需添加其他显色试剂，就可直接测定反应物的变化，可以明确找到反应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定。主要缺点 在特定条件下进行，要求精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件，对仪器要求较高，需要具有恒温装置和连续记录吸光度装置。,（二）特点,第38页,（三）计算,第39页,连续监测法,色素原底物,NAD(P)H系统,过氧化物酶系统,其他,ALP、ALP、GGT、GPDA、AMS、AFU,LD、G6PD、HBDH、AD、SD、GLD、ALT、AST、CK 、ADA,LPS、ADA、 5-NT,CHE、ACP,（四）方法设计,第40页,定时法,连续监测法,测总变化量，平均速度,测速率,终止酶促反应,酶促反应一直进行,多用化学方法检测,多用酶偶联反应,定时法与连续监测法的区别,含延滞期或非线性期,只计算线性期速度,第41页,酶活性测定最适条件,一,二,三,第二节 酶活性测定的影响因素和最适条件,酶活性测定的影响因素,最适条件的确定,第42页,一、酶活性测定最适条件,最适条件（optimum condition）：是指能满足酶发挥最大催化效率所需的条件。酶的催化活性与酶促反应的最大速度成正比例，只有当反应速度为最大反应速度时V才与酶量E成正比例。只有在最适条件下的测定方法才是可靠的、准确的。,第43页,主要包括：1.底物种类和底物浓度2.缓冲液种类和离子强度；反应液的最适pH3.反应温度4.辅因子、激活剂浓度，指示酶和辅助酶的用量5.测定时间，延滞期应尽量短暂并有足够的线性期6.样品与反应试剂的比例，检测范围,二、酶活性测定的影响因素,S,P,E,t,酶量,测定方法,反应时间,10 20 Km,缓冲液,抑制剂,底物,激活剂,第45页,（一）底物的确定,底物选择的原则是：选择Km最小的底物要有足够的溶解度酶对底物特异性高底物稳定性好较高临床价值的底物,三、最适条件的确定,第46页,单底物酶促反应：选择S10Km20Km，此时反应速度达到最大反应速度90.9% 95.2% 双底物酶促反应：A/B之间的关系是一条双曲线，有无数组数据。采取最经济原则。F（一般选90%或95%）,底物确定的方法,第47页,（二）缓冲液的确定,缓冲液种类的选择原则：尽量使用活性缓冲液 pKa与测定pH比较接近，有足够的缓冲容量 纯度高，不含有抑制酶活性的杂质 温度依数性小 对酶有稳定作用,第48页,缓冲液离子强度的确定：离子强度越高，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，能满足缓冲容量的要求即可。大多数酶活性测定的离子强度在0.1mmol/L左右 ALP用AMP缓冲液，离子强度达到0.9mmol/L，有磷酸基团接受体作用GGT用高浓度的双甘肽有酰基接受体作用,第49页,第50页,常用的缓冲液：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）N，N-双（2-乙磺酸）哌嗪（PIPES）三羟甲基氨基甲烷（Tris）二乙醇胺（DEA）三乙醇胺（TRA）2-甲基-2-氨基-1丙醇（AMP）,第51页,在1986年以前IFCC推荐酶活性测定的温度是30 2002年IFCC正式发表了“37下检测酶催化活性浓度的IFCC一级参考方法操作手册和参考制品认可系统”目前基本无异议，确定37为酶活性测定温度,（三）反应温度的确定,第52页,（四）辅助因子、辅助酶的确定,脱辅基酶的酶活性恢复预孵育期 EDTA络合重金属离子巯基酶需巯基试剂做激活剂反复实验法确定用量,第53页,（五）反应时间的确定,延滞期的确定原则是多观察几例浓度不等、病理情况不同的标本，选择延滞期最长者作为确定值。线性期的确定 线性期的确定与酶浓度的可测上限与非线性度有关。计算非线性度，按最小二乘法的计算要求，读数次数应不少于4次，读数间隔按一般仪器要求30 s就足够了，线性期在2min以上即可。,第54页,基本方法因素的影响,一,二,三,第三节 方法因素对酶活性测定的影响,检测系统的影响,其他因素的影响,一、基本方法因素的影响,电位滴定法,浊度法,时间滴定法,比色法,分光光度法,生物传感器,荧光,按监测手段,各类终点法,LPS,NAD(P)H,AMS,CHE,NAD(P)H,ALT,（一）方法分类,第56页,终点法,测产物,测底物,连续监测法,按监测对象,按监测速度方式,样品启动,逆向,正向,底物启动,按反应方向,按启动类型,第57页,根据产物生成量或底物消耗量(C)与酶活性(v)、酶量（E)、反应时间(t)成正比例的关系。如淀粉酶（碘淀粉显色原理）测定又可分为： 样品稀释法-改变E 时间滴定法-改变t 碘淀粉比色法- -改变v,第58页,（二）检测方式,1、产物生成类：根据产物生成量与酶活性、酶量、反应时间成正比例的关系，从无到有，从少到多进行测定，检测敏感度高。 2、底物消耗类：测定底物，从多到少，而底物消耗不明显，测定误差大，检测范围窄。如碘淀粉比色法。,第59页,（三）启动模式,指反应所需的试剂先混合在一起，然后加入样品，依靠样品中的待测酶来启动酶促反应，只在延滞期去除部分干扰物，抗干扰能力等同单一试剂剂型，需要注意的是某些双试剂剂型是基于试剂稳定性考虑，并没有单独将底物作为第二试剂，也起不到消除内源性干扰的作用。,样品启动模式,第60页,指样品先与部分试剂（缺乏某个底物）预孵育一定时间，部分消除某些内源性、外源性干扰物以及杂酶的副反应，然后加入这个底物，启动待测酶酶促反应。需要双试剂剂型，IFCC推荐法多采用底物启动模式。,底物启动模式,第61页,二、检测系统的影响,不同的仪器，波长的设置有区别，带宽有区别，比色杯的透光性在使用过程中也会发生改变，这些都直接影响仪器对待测物的摩尔吸光系数，也就影响K值的准确性。因此，要定期检查仪器的摩尔吸光系数，校正K值。,（一）检测仪器,第62页,产物的基准物质：如对硝基酚、对硝基苯胺等，可用于校准仪器的摩尔吸光系数。产物NAD（P）H的摩尔吸光系数可以用葡萄糖测定试剂（己糖激酶法）来校正。 酶校准物：多是用人血清或动物血清作介质，与测定标本比较接近。,（二）校准物,第63页,（三）实验参数,一般参数：1.项目名称；2.方法类别；3.试剂类别；4.试剂位置；5.标本位置；6.冲洗次数 技术参数：1.方法类型；2.波长选择；3.样品用量4.试剂用量5.稀释水量；6.试剂吸光度上下限；7.空白速率 时间参数：1.孵育时间；2.延迟时间；3.监测时间；4.底物耗尽时间 质控参数：1.参考值范围；2.线性范围；3.计算因子F值,三、其他因素的影响,参考系统IFCC推荐方法参考程序参考实验室,室内质控仪器之间比对,室间质评系统之间比对,测定系统IFCC推荐方法操作程序试剂合制造商,测定系统IFCC推荐方法操作程序临床检验实验室,酶参考物,移植的酶校正物,参考网络实验室定值,试剂盒酶校正物,溯源链,厂家网络实验室定值,第65页,按照理化性质不同进行分离鉴定,一,二,第四节 同工酶检测技术,按照其他性质不同进行鉴定,第66页,同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的一组酶称为同工酶（isoezyme）。凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶，而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶或酶多种形式。某些同工酶从组织进入体液后在蛋白酶作用下降解成不同的亚型（isoform）。,同工酶及亚型的概念,第67页,电泳法由于各型同工酶的一级结构或空间构象不同，形状也不同，因而带电性质不同，在电场中的电泳迁移率不同，使各型同工酶分离,然后用酶催化性质选择合适的显色系统使区带呈色。评价：优点是可获得同工酶谱的全貌 缺点是其显色系统不可能是所有同工酶的最适条件，而且定量也比较困难酶与体内的白蛋白、免疫球蛋白等复合物形成“矫作物”,第68页,第69页,蛋白质,同工酶,支持物准备、平衡、加样、电泳,固定后染色蛋白质染料,不固定酶促反应产物显色,扫描定量,扫描定量,电泳法测定同工酶与蛋白