蛋白质、多肽类药物质量控制

蛋白质、多肽类药物质量控制,生化室2018.4.13上海,蛋白质、多肽类药物,由50个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质，所以蛋白质和多肽没有明显的区别。,优点：生物活性高，特异性强，毒性低。,缺点：稳定性差，容易失活,大分子，多组分。,奥曲肽,醋酸戈那瑞琳,太难,蛋白质、多肽药物质量控制,1.鉴别2.检查3.含量测定,1.鉴别,1.1化学反应1.2高效液相色谱（保留时间）1.3红外光谱（去氨加压素）1.4紫外光谱1.5肽图分析（重组肽）1.6核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林）1.7毛细管电泳（重组肽）1.8液质联用（去氨加压素）1.9圆二色光谱（测定蛋白质二级结构）1.10比旋度等,1.5肽图分析中国药典2015年版四部通则3405肽图检查法第一法胰蛋白酶裂解反相高效液相色谱法供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后，离心取上清。液相C18或C8柱，0.1%三氟乙酸的水和0.1%三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长214nm。第二法溴化氰裂解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。,事实是基本做不出来一样的,肽图分析存在的问题,系统适用性在哪里？实验中复杂的前处理过程如何重现？粗犷的规定如何统一判定尺度？,向抗生素和中药学习，规定特征峰，给出标准图谱，去溶剂峰，引入相似度评价，给出推荐色谱柱，给出积分条件，空白溶液制备方法等。,2.检查,2.1氨基酸分析2.2分子量与分子量分布2.3有关物质2.4热原2.5残留溶剂,2.1氨基酸分析,2.1.1酸水解6mol/L盐酸，110，真空，20-24小时。,优点：氨基酸不消旋。,缺点：色氨酸被完全破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺完全水解，胱氨酸不能直接测定。,2.1氨基酸分析,2.1.2碱水解5mol/L氢氧化钠溶液，充氮封管，110，22小时。,优点：色氨酸稳定。,缺点：氨基酸外消旋化，多数氨基酸被破坏。,2.1氨基酸分析,2.1.3酶水解一组蛋白酶,优点：条件温和，氨基酸不消旋，不被破坏。,缺点：水解不完全。,2.1氨基酸分析,2.1.4柱后衍生化色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺）反应。,优点：容易定量和自动化操作。,缺点：灵敏度低，需要额外设备，峰展宽，分辨率低。,2.1氨基酸分析,2.1.5柱前衍生化氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基甲酰等）反应，再分离检测。,优点：灵敏度高，分辨率高，普通HPLC即可分析。,缺点：部分衍生物不稳定，副产物干扰分离检测。,番外篇氨基酸类药物的有关物质研究,目前中国药典2015年版对于氨基酸类制剂的杂质控制是测定“其他氨基酸”，采用TLC法喷茚三酮试液显色。其他杂质如何控制？,难点：种类多，分子量小，弱紫外吸收，两性电解质，溶解性差异大。杂质来源：不稳定氨基酸，高温灭菌，生产工艺差距。,2.2分子量与分子量分布,2.2.1分子排阻色谱,2.2分子量与分子量分布,2.2.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,2.2分子量与分子量分布,2.2.3ESI-MS,2.2分子量与分子量分布,2.2.4MALDITOF,2.3有关物质,2.3有关物质,2.3.1反相高效液相色谱灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段。2.3.2毛细管电泳消耗少，多种分离模式，操作简便。2.3.3液质联用特异性强，极高灵敏度。2.3.4高效分子排阻色谱用于高分子量蛋白物质检查。,2.4热原,2.4.1家兔法兔子不稳定2.4.2鲎试剂只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖2.4.3人全血细胞新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽。2.4.4人源单核细胞系针对不同热原-内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合基质多样的生物大分子的热原检查。,2.5残留溶剂,气相顶空进样最好不用液体进样，堵针，堵进样口。不行就上气质联用。,3.含量测定,3.1凯氏定氮法3.2福林酚法3.3双缩脲法3.4BCA法3.5考马斯亮蓝法3.6紫外分光光度法3.7荧光分光光度法,3.8蛋白质印迹法3.9高效液相色谱法3.10毛细管电泳法3.11电位滴定法3.12效价测定3.13氨基酸比值,3.1凯氏定氮法,原理：蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后在碱性条件下蒸馏将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，计算出样品中的氮量。由于蛋白质含氮量比较恒定，蛋白质含量=含氮量/16%，可由其氮量计算蛋白质含量。,3.1凯氏定氮法,3.2福林酚法,原理：在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成络合物，蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基将FolIn试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐中六价钨还原成深蓝色混合物。在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比。,3.2福林酚法,3.3双缩脲法,原理：在强碱性溶液中，蛋白质肽键与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关。,测定肽键是真实的测定蛋白质,3.3双缩脲法,3.4BCA法,原理：碱性条件下，蛋白质与Cu2+络合，并将其还原成Cu+，Cu+与BCA试剂发生络合，使其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处吸光度与蛋白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系。,2.2-二辛可宁酸,3.4BCA法,3.5考马斯亮蓝法,原理：游离状态下呈红色的有机染料，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，最大吸收波长从465nm变为595nm。A595与蛋白质含量呈正比。,CoomassiebrilliantblueG-250,不能用石英杯,3.5考马斯亮蓝法,3.6紫外分光光度法,原理：酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在280nm处有吸收峰，吸光度与蛋白质含量成正比。,3.6紫外分光光度法,3.7荧光分光光度法,原理：当溶液中含有表面活性剂时，荧光染料分子之间通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体，多聚体的形成导致荧光强度降低。然后加入蛋白质溶液，导致多聚体解聚而使荧光强度增加。在一定蛋白质浓度范围内，荧光信号强度与蛋白质的浓度成正比。,3.7荧光分光光度法,3.8蛋白质印迹法,原理：将混合蛋白质进行电泳分离，将产物电转移到硝酸纤维膜上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影检测蛋白成分。,3.8蛋白质印迹法,3.9高效液相色谱法,原理：酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在280nm处有紫外吸