药学中的生物技术和方法ADMET方法

III -药物发现中的ADMET方法,什么是ADMET,Absorption 吸收Distribution 分布Metabolism 代谢Excretion 排出Toxicity 毒性ADME是药物动力学(Pharmacokinetics, PK)的内容,成功药物是个平衡体,药物活性,药物毒性,药物必备性质,药物必备性质 -药物开发的前提条件,物理化学性质溶解性化学稳定性生物学性质生物屏障渗透能力药物代谢性质（生物稳定性）药物排出性质蛋白质和器官组织的结合力,药物研发的并行策略,合成化合物或分离天然产物,生物活性 生物选择性 物理化学性质 药物吸收 药物代谢 大分子结合 细胞毒性 ,优化的先导化合物,候选药物,现代ADMET研究方法的特点,基于细胞或生物大分子的分析方法人源材料的应用小样品、高内涵和高通量分析能力能够阐明药物性质的分子机理、建立结构-药物性质定量构效关系,合理药物运输/制剂系统,以往的研究表明：药物运输系统只能辅助而不能根本性的改变药物的口服吸收能力合理的药物运输/制剂系统(rational drug delivery)必须依据药物本身的穿越消化肠道屏障的渗透能力,BCS系统,FDA制定了BCS的评价指南。BCS的评价主要包括下列三个方面： 药物的生物渗透能力（permeability） 药物的溶解能力（Solubility） 制剂的快速溶出能力（Immediate Release）上述性质符合要求的药物/制剂可以在药审时得到生物豁免。,药物吸收,吸收屏障结构,底侧（Basolateral）,顶侧（Apical）,经细胞连接的被动扩散Paracellular diffusion,穿细胞被动扩散Transcellular diffusion,代谢转化A B,外流Efflux,药物转运transport,A,C,D,药物消化道吸收的基本机制,体外单层肠上皮细胞药物吸收模型,肠上皮细胞/细胞系,组织/细胞培养,多空膜基底,吸收细胞单层,Transwell细胞培养板,已被认证的用于药物吸收的细胞系,Caco-2人结肠腺癌细胞具有分化的肠上皮细胞特征和重要的药物转运与代谢酶MDCK 狗肾上皮细胞系,Caco-2药物吸收模型的创建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究团队,Caco-2模型的制备过程,细胞培养,Transwell接种,细胞汇合,细胞分化完备,细胞收集,2-3天,2-3天,23星期,药物吸收测试,试验结果-渗透能力,吸收较好的药物： Papp 210-6Testosterone：1.010-5 cm/sPropranolol: 2.8610-5cm/s吸收差药物： Papp 10-6Mannitol：1.010-7 cm/sAtenolol: Papp= 4.5510-7 cm/s,Brain Blood Barrier（BBB）,BBB结构,内皮细胞和星形胶质细胞的相互作用,星形胶质细胞毛细血管内皮细胞促进细胞紧密连接诱导一些酶和分子转运蛋白调节内皮细胞生长毛细血管内皮细胞星形胶质细胞趋化现象表型的调节,BBB渗透机理,influx,efflux,紧密连接（tight junction）的结构,AP端：血液,BL端：脑实质,毛细血管内皮细胞,胶质细胞,神经胶质细胞,毛细血管内皮细胞,基底膜,多孔聚碳酯膜,药物排出,药物清除 = 代谢 + 排出,肾排出：超滤机制,游离小分子药物及其代谢物,肾小球,肾小管,药物重吸收,大分子化合物大分子结合药物,肾排出因素：PPB 和 Papp,(Absorption fraction 0.9),(PPB0.05),胆汁分泌和肠肝循环,Drug,Binding to cytoplasmic proteins,肝脏处置药物的基本途径,胆汁,NTCP,OATPs,OAT2,OATP2,MRPs,MDR1,BCRP,BSEP/SPGP,肠道,药物,药物,代谢物,Basal（blood）,Apical（bile）,OATP2,MDCKII,(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277(8), 6497-6593 (2002),药物经胆汁排出的细胞模型- OATP2/MRP2 双转染 MDCK细胞单层,MRP2/cMOAT,药物的肝脏代谢,药物代谢的基本过程,药物R,氧化产物R-OH,结合产物R-O-X,排出物,I相代谢,II相代谢,II+相代谢：药物外流,II相代谢,水解产物,X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione,I相代谢关键酶-细胞色素P450,细胞色素P450 (CYP)家族CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4NADPH依赖的氧化酶CYP3A4 是药物的主要代谢酶50%已知药物通过CYP3A4代谢,II 相代谢关键酶,UDP-依赖葡糖醛酸基转移酶(UGT)苯酚磺基转移酶 (PST)雌激素磺基转移酶 (EST)谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)一些细胞抗氧化酶,三种肝细胞制品及代谢分析,全肝细胞代谢分析,肝微粒体代谢分析,S-9肝匀浆液代谢分析,药物肝脏代谢稳定性分析过程,药物肝脏代谢稳定性分析结果,% 原药消失率 =,（1 - ）100%,原始药物浓度c0,代谢反应后药物浓度ct,全肝细胞(),肝微粒体(),仅包括I相代谢酶 易于保存 分析操作容易、费用低,包括所有代谢酶和转运蛋白 费用高，细胞保存不易,S9肝匀浆液(),包括主要I、II相代谢酶 分析操作容易、费用低 匀浆液保存不稳定,药物毒性,药物毒性评价的基本方式-细胞活力分析,细胞生长细胞能荷线粒体活性-MTT分析细胞氧化还原状态-谷胱甘肽含量分析细胞特征性功能蛋白质合成核酸合成吞噬、排除外来分子能力等细胞膜完整性-胞浆酶活性分析,MTT细胞活力分析,原理：线粒体酶将探针分子MTT*还原成为一种蓝色脂溶性染料formazan（吸收波长550nm）线粒体活性越高，转化能力越强 实验方法：将MTT加入到细胞培养液中，反应一段时间后，用有机溶剂溶解产生的formazan，然后用酶标仪测定 550 nm吸光度. 特点：方法简单可靠，费用低，高通量,* MTT：3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,药物毒性分析过程,LD50，IC50，EC50,线粒体毒性模型,Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological DevelopmentWorld Pharmaceutical Congress, June, 2010,ROS,ATP synthesis,Cyt c,Djm,关于药物毒性分析数据,毒性分析的结果是LD50或IC50或EC50，表示药物导致细胞活力降低一半时需要的浓度LD50或IC50或EC50越小，药物毒性越大每种细胞活力分析方法都具有片面性，多种方法测定一种化合物毒性是有益的进行药物毒性分析时，推荐使用人源的原代完整肝细胞，数据可靠性高当使用永生化细胞和肿瘤细胞时，由于这些细胞(特别是肿瘤细胞)的药物代谢能力较差，因此得到的细胞毒性数据是一种“本征毒性(intrinsic toxicity)”。将实验数据推广应用时，注意补偿不同组织细胞的代谢能力。,药物毒性和药物-药物相互作用,排出抑制型相互作用：药物1抑制药物2的排出，导致药物2浓度过高产生毒性代谢抑制型相互作用药物1抑制药物2的代谢，导致药物2浓度过高产生毒性代谢诱导型相互作用药物2诱导药物2的代谢，导致药物2被过度活化，使代谢毒性产物浓度增加药物2因代谢失效,小结：ADMET研究诸方面,ADME：生物利用率,药物间相互作用,药物分布,血浆蛋白结合力,血脑屏障渗透能力,药物清除,药物吸收,消化道稳定性,肾排出,肝脏清除,代谢稳定性,胆汁排出,溶解性,渗透能力,代谢诱导,代谢抑制,药物毒性T,细胞活力抑制分析,排出抑制,扩散能力,药物外流载体,药物吸收载体,代谢酶亚型,一个例子- 食物中的黄酮类化合物,食物成分黄酮类化合物及其作用,雌激素样作用弱类雌激素活性防治一些和激素水平下降有关的疾病，如衰老、更年期综合症、骨质疏松、血脂升高等抗雌激素活性预防激素依赖型肿瘤及心血管疾病的发生。抗氧化作用抑制肿瘤作用降低胆固醇、调节血脂，预防心血管疾病和老年性痴呆症,黄酮通式,异黄酮通式,黄酮苷和黄酮苷元,大豆异黄酮苷元,大豆异黄酮葡萄糖甙,水解,b-葡萄糖苷酶（肠道微生物）,肠道乳糖-根皮素水解酶,O,黄酮类化合物的吸收代谢机制,黄酮苷,黄酮苷元,水解,CYPs 代谢分解,MRP2,BCRP,UGT,SulT,紧密连接,MRP3,酶水解,酶水解,肝、肾排出,黄酮类化合物吸收的关键因素,黄酮苷的水解-利于吸收因素肠道正常细菌群黄酮苷元的代谢稳定性-不利于吸收因素II相代谢和II+向外排出I相氧化分解解决方法：混合黄酮制剂苷元羟基甲基化,思考题,什么是ADMET研究，在药物发现中的作用是什么？现代ADMET方法有什么特点？什么是BCS？药物消化道吸收的分子机制有那些？什么是Caco-2模型？如何从