中药龟甲胶的质量控制方法研究.docx

中药龟甲胶的质量控制方法研究刘琳 1，张贵锋 2*，查圣华 3，孔英俊 2，高建萍 2，王明林 1*，张宏 3，苏志国 2（1山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安 271018； 2中科院过程工程研究所，北京 100190； 3同仁堂健康药业股份有限公司，北京 100022）摘要 目的：研究龟甲胶酶产物的多肽组成，探索基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法；方法：利用液质联用技术结合酶解技术，比较龟甲胶和牛明胶酶解产物的多肽组成，筛选差异性多肽；结果：龟甲胶酶解 产物中检测出特征多肽，其对应离子分别为 m/z 856.0 和 m/z 732.7，而牛明胶中检测出的多肽(m/z 727.8 和 m/z 782.5)在龟甲胶酶解产物中未检测出。结论：龟甲胶和牛明胶酶解产物存在差异性多肽，基于特征多肽 或特征离子的龟甲胶质量控制方法具有可行性。关键词 龟甲胶；质量控制；牛明胶；特征多肽；液质联用龟甲胶是龟甲经过漂泡、煎煮和浓缩等处理并添加辅料制成的固体胶，其功效包括滋阴潜阳、益肾强骨和养血补心等。龟甲胶主要成分为可溶性胶原蛋白及其降解产物1-3。近 年来随着龟甲胶等胶类中药的需求量不断上升，市场上出现了掺加牛皮胶甚至皮革降解物伪 品龟甲胶，其有效功效较低甚至产生毒副作用。研究龟甲胶中蛋白质或多肽组成并筛选特征 性多肽不仅有利于龟甲胶质量控制，而且有利于建立相应的真伪鉴别方法。张思巨4等采用 IR、UV、TCL 和 HPLC 等技术研究了龟甲胶、鹿角胶和阿胶的理化性 质并尝试用于三种胶的鉴别，但由于不同动物胶的宏观性质相似，采用这些方法难以获得有 显著差异的信息。李春梅5等人利用 SELDI-TOF MS 分析了龟甲胶的蛋白质组成，但未比较 不同动物胶的蛋白质或多肽组成差异。其它方法如示差扫描量热法6、等电聚焦电泳法7和 圆二色谱法8等也曾尝试用于胶类中药的鉴别。由于胶类中药制备过程中需添加辅料且不同 厂家使用的辅料存在差异，龟甲胶在成分、分子量范围和光谱特性等性质不稳定。龟甲胶中存在大量的胶原蛋白降解物，不同动物来源的胶原蛋白其氨基酸序列会存在 差异9，这些差异可作为区分不同动物胶原或明胶的依据9,10。本研究拟采用 HPLC-MS 结 合蛋白酶切技术比较龟甲胶和牛皮胶酶解产物中的多肽组成差异，筛选特征离子或特征多 肽，探索一种基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法。1 材料与方法1.1 样品来源龟甲胶购自北京同仁堂药店；牛明胶购自美国 Sigma 公司。1.2 仪器与试剂胰蛋白酶(序列纯)购自美国 Promega 公司；牛 I 型明胶购自美国 Sigma 公司， 2,4-二硝 基氟苯(DNFB)购自 Acros Organics 公司，其他试剂均为市售分析纯。液质联用系统由 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo 公司 LCQ DecaXP 质谱组成，数据采集与处理软件分别为 Xcalibur1.3 和 Biowroks3.1。2891.3 实验方法1.3.1 样品处理称取 1 g 研磨后的龟甲胶样品，加入 20 mL 水，50水浴溶解，室温 10 000 r min-1 离心 15 min，取清液加入 20%饱和三氯乙酸，4保存 10 min，10 000 r min-1 离心 15 min，收 集上清液和沉淀物。将沉淀物重新溶解于水中，调 pH8.0，加入 100 L 胰蛋白酶 37酶解 12 h，采用 HPLC-MS 分析其多肽组成。1.3.2 分析方法1.3.2.1 凝胶过滤色谱分析 色谱柱 TSK G3000SWxL(7.830 cm, 5 m)；流动相 0.02 mol L-1磷酸缓冲液(pH7.0)；流速 0.5 mL min-1；进样量 20 L；紫外检测波长 214 nm。1.3.2.2 氨基酸组成分析 样品水解、DNFB 法氨基酸衍生和液相条件分析条件参照文献11。1.3.2.3 高效液相色谱质谱联用分析色谱柱 ZORBAX SB-C18(2.1150 mm, 5 m)；流动相： 水(0.1%TFA)(A), 乙腈(0.1%TFA)(B)；梯度 0100 min，5%40%B；100120 min，40%70%B；进样量样品 20 L；流速 0.2 mL min-1。质谱条件喷雾电压 4.5 kV；毛细管温度为 300； 鞘气(N2)60 个单位；正离子模式，一级质谱扫描范围 m/z300900,精确质量数扫描(Zoomscan) 和二级质谱(MS/MS)扫描均为数据依赖型扫描(Data Dependent Scan)；动态排除次数 1；动态 排除时间 0.5 min；二级质谱碰撞能量 35%，上述质谱条件中扫描范围更改为 m/z 9001 400 和 1 4002 000，重复进样。1.3.2.4 数据处理从 UniProtKB/Swiss-Prot 数据库中提取全部胶原蛋白序列的数据库。将质 谱数据使用 Biowork 软件中 Turbosequest 进行数据库检索，检索结果过滤参数：Xcorr1.5， DeltaCn0.1，二级质谱离子数量15，并综合考虑目标离子色谱峰的信噪比及二级质谱图中 b、y 离子匹配性和连续性。2 结果2.1 凝胶过滤色谱分析 龟甲胶样品溶解后经离心处理形成上下两层，上次呈乳白色粘稠状，下层为澄清透明的溶液。有研究报道龟甲胶中主要包含蛋白质和多肽类、多糖类和脂类物质11,12，样品溶液经 离心后分成的两层中上层主要为脂类物质，多糖和蛋白质及多肽类物质分布在下层溶液，图 1A 是下层溶液的凝胶过滤色谱图。下层溶液经 TCA 处理后出现沉淀物，实验采用凝胶过滤 色谱对上清液和重新溶解的沉淀物进行了分析。图 1B 是下层沉淀物重新溶解后的凝胶过滤 分析结果，表明样品溶解经 TCA 沉淀后下层沉淀物具有较高的分子量分布，沉淀物经考马 斯亮蓝法分析的结果表明沉淀物主要是蛋白类物质。上清液中的组分平均分子量较低，在保 留时间 1320 min 范围内未检测分子量较高的组分(图 1C)。由于糖类物质在 TCA 溶液中可 溶解，因此，TCA 沉淀处理后样品中的多糖类物质主要存在于上清液。考马斯亮蓝法分析 结果表明上清液中存在少量蛋白或多肽类物质，但平均分子量较低，应属于胶原蛋白降解后 的低分子量多肽类物质。实验将沉淀物充分洗涤后进行了酶解处理，图 1D 是酶解产物的凝胶过滤分析结果，表 明沉淀物的酶解液保留时间主要集中在 29 min 左右，比图 1B 保留时间 13.5 min 明显延后， 说明龟甲胶中蛋白质被酶解成分子质量较小的多肽片段。2.2 氨基酸组成分析290为研究龟甲胶中蛋白质的性质，实验首先将经过 TCA 处理后的沉淀物进行了水解，采用 DNFB 法衍生后采用 HPLC 进行了氨基酸组成分析。图 2 是样品的氨基酸组成分析 HPLC 图谱，氨基酸组成分析结果见表 1，结果表明龟甲胶含有胶原蛋白特有的羟脯氨酸，含量约 占总氨基酸含量的 10%，与脯氨酸之和约占 20%，甘氨酸含量约占 32.5%，未检出蛋氨酸和 半胱氨酸，这种氨基酸组成与胶原蛋白的氨基酸组成特征较为一致，说明龟甲胶中主要蛋白 质是胶原蛋白。样品中甘氨酸含量低于 33%(胶原蛋白核心序列氨基酸组成特征)，表明龟甲 胶中也存在少量的非胶原类蛋白质或多肽13。A龟甲胶溶解并离心后的清液；B龟甲胶溶液离心后的清液经过 TCA 处理后的沉淀物；C龟甲胶溶液离心后的清液经过 TCA 处理后的上清液；D龟甲胶溶液离心后的清液经过 TCA 处理后的沉淀物酶解 产物图 1 龟甲胶的凝胶过滤谱图图 2 龟甲胶氨基酸组成分析 HPLC 图表 1 氨基酸组成分析表氨基酸含量*氨基酸含量*天冬氨酸谷氨酸 羟脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 甘氨酸 脯氨酸 精氨酸6310399321632510953丙氨酸缬氨酸 异亮氨酸 亮氨酸 苯丙氨酸 组氨酸 赖氨酸 酪氨酸95221528103244注：*龟甲胶中氨基酸含量以每 1000 个氨基酸残基中的氨基酸的比例计算291图 3 牛明胶(A)和龟甲胶(B)酶解产物质谱分析总离子流图2.3 酶解产物 HPLC-MS 分析氨基酸组成分析结果表明龟甲胶中主要是胶原蛋白降解物，分子量分布范围宽且多肽 的亲疏水性相近。图 3 表明龟甲胶的酶解质谱图与牛明胶酶解产物质谱图中多肽的保留时间 分布和分子量范围较为相似，质谱数据的检索结果也表明两种胶的酶解产物中存在大量相同 氨基酸序列的多肽，其原因在于不同动物来源胶原蛋白的整体氨基酸组成差异并不显著且存 在局部相同的氨基酸序列，酶解后这些多肽被释放并形成质荷比相同的离子。不同动物来源的胶原蛋白序列存在局部氨基酸差异，胶原蛋白降解后的明胶经酶解处 理后可形成有序列差异的多肽。实验采用数据比对的方法对图 3 中龟甲胶与牛明胶的酶解产 物的质谱数据进行了分析，并对存在差异的离子进行了筛选，结果表明龟甲胶酶解产物中存 在部分多肽，这些多肽对应的离子在牛明胶酶解产物中未检出。图 4 是龟甲胶酶解产物质谱 分析获得的提取离子流图，检测出保留时间为 37.15 min 特征性多肽(m/z 856.0)；尽管牛明 胶中存在保留时间为 57.99 min 的 m/z 856.0 离子(图 4B)，但其带电荷状态以及二级质谱均与 图 4A 中离子 m/z 856.0 的带电荷状态以及二级质谱存在显著差异，表明其氨基酸序列不同。 龟甲胶中存在保留时间为 40.68 min 的特征性多肽(m/z 732.7)(图 4C)，而牛明胶酶解产物中 未检测出该离子以及对应的多肽(图 4D)。数据检索结果表明龟甲胶中还存在其它特征多肽，这些多肽与牛胶原蛋白序列中对应的多肽局部氨基酸残基发生了变化。A.龟甲胶 m/z 856.0；B.牛明胶 m/z 856.0；C.龟甲胶 m/z 732.7；D.牛明胶 m/z 732.7图 4 龟甲胶和牛明胶酶解产物提取离子流图292数据比对结果表明牛明胶酶解产物也存在许多特征多肽，其对应的离子在龟甲胶酶解产物中未检测出，这些多肽可作为鉴定龟甲胶样品中是否存在牛明胶的标志物。图 5 是牛明 胶酶解产物质谱分析后的提取离子流图，检测出保留时间为 52.06 min 特征性多肽 (m/z727.8)(图 5B)，而龟甲胶酶解产物中未检测出该多肽(图 5A)；牛明胶酶解产物中检测出 m/z782.5 的特征多肽，其保留时间分别为 45.33 min、46.75 min、48.43 min 和 49.54 min(图 5D)，而龟甲胶酶解产物中未检测出 m/z782.5 的多肽(图 5C)。牛明胶酶解产物的质谱数据搜 集结果还存在其它多肽，其序列具有特征性且在龟甲胶酶解产物中未被检测。A.龟甲胶 m/z 727.8；B.牛明胶 m/z 727.8；C.龟甲胶 m/z 782.5；D 牛明胶 m/z 782.5图 5 龟甲胶和牛明胶酶解产物提取离子流图脯氨酸(Pro)羟基化修饰形成羟脯氨酸是胶原蛋白序列中最为常见的翻译后修饰，有研究表明哺乳动物在其不同生长时期以及不同组织中，羟基化修饰位置和修饰程度存在一定差 异，使用质谱法进行多肽识别需综合考虑多肽可能存在的羟基化修饰。牛明胶酶解产物提取 离子流图中保留时间分别为 45.33 , 46.75 , 48.43, 49.54 min 色谱峰中多肽具有相同的质荷比 (m/z 782.5)，序列分析结果表明这些多肽具有相同的氨基酸序列，但羟基化修饰位置存在差 异。利用质谱技术检测龟甲胶中特征多肽过程中，不同样品中特征多肽的 Xcorr 和 DeltaCn 值可能会出现波动，主要原因在于脯氨酸的羟基化修饰不均一导致同一序列出现多条检索结 果，需要结合多级质谱技术通过碎片离子的种类确定发生羟基化修饰的具体位置。3 讨论龟甲胶以龟甲为原料经熬制并添加一些辅料制成，龟甲中存在蛋白质(胶原蛋白和角蛋 白等)、糖胺多糖、脂类和无机盐14-16等，这些物质在熬制过程中发生降解导致组成更为复 杂，基于理化性质的鉴别方法存在诸多不稳定因素。为了去除样品中的非胶原多肽类物质的 干扰，实验首先采用沉淀法对样品进行了预处理，以使高分子量的胶原蛋白降解物沉淀出， 提高特征多肽的检出率。龟甲中胶原蛋白含量较高，因此龟甲胶中含有一定量的胶原蛋白降 解物，不同动物胶原蛋白之间的氨基酸序列差异是基于特征多肽的质量控制方法的理论基 础。然而，由于龟甲胶分子量高且分布范围宽，难以采用质谱直接进行分析，因此实验采用 酶解技术进行了样品处理，以降低龟甲胶中多肽的分子量并使特征多肽得以释放。293由于胶原蛋白随着动物年龄和生长情况发生动态变化，导致龟甲中脯氨酸和羟脯氨酸相对比例发生变化，利用质谱技术检测龟甲胶中的特征多肽需考虑羟基化修饰的影响，尤其 是质谱数据解析时需要在搜索参数中设置脯氨酸发生羟基化修饰的参数,以提高特征多肽的 识别率。本研究以不同动物之间胶原蛋白序列差异为基础，采用液质联用技术结合蛋白质酶解 技术进行了多肽检测，证明了基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法具有可行性，为深入研究龟甲胶的组成以及相应的有效成分研究提供了理论基础。参考文献1Nobuhiro Naqai, Hatsumi Kobayashi, Shizuka Katayama, et al. 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