【毕业学位论文】（Word原稿）小麦不同外植体农杆菌转化体系研究作物遗传育种硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 小麦不同外植体农杆菌转化体系研究 摘 要 目前为止，小麦幼胚是利用农杆菌介导法成功转化小麦的唯一外植体， 常用的基因型，不但小麦幼胚的取材受季节的严格限制，而且存在着基因型单一、转化效率不稳定等缺点。筛选对农杆菌敏感的小麦基因型，建立或完善农杆菌转化小麦成熟胚、幼穗和幼胚的技术 体系，同时将一些与性状改良有关的功能基因导入小麦，对于小麦新品种选育和功能基因组研究具有重要意义。本研究选用来自全国各地的 91 个小麦基因型，分别以其成熟胚、幼穗和幼胚为受体材料进行农杆菌转化，通过 因的瞬间表达筛选对农杆菌敏感的小麦基因型，通过对受体材料处理方式和共培养方式的比较等技术环节的研究，将高分子量麦谷蛋白亚基编码基因 154X、 154Y、 标记基因 I、报告基因 入小麦。 通过农杆菌侵染后 因瞬间表达，从 80 个小麦品种中筛选到了 97选 208、豫麦 66、扬 麦 6号等基因型，其幼胚对农杆菌感染非常敏感， 从 83 个小麦品种中筛选到京冬 8 号、 农 2611、京冬 11 等基因型的幼穗经对农杆菌感染比较敏感， 因瞬间表达率达到了 多数基因型的幼穗对农杆菌感染不敏感。对小麦受体组织与农杆菌的共培养方式进行了比较，结果表明，滤纸上共培养方式更有利于农杆菌对小麦三种不同外植体的侵染，滤纸上共培养方式 因表达率平均比固体培养基共培养方式高 对小麦成熟胚在农杆菌感染前采用了三种不同的 处理方法，结果表明，成熟胚纵切成两半后直接进行农杆菌转化更有利于农杆菌的侵染和抗性愈伤组织诱导、再生，首次利用农杆菌介导法转化小麦成熟胚获得了小麦转基因植株。利用农杆菌介导法转化小麦幼胚也获得了转基因植株，利用农杆菌介导法转化小麦幼穗获得了抗性再生植株。对转基因植株进行了 测、测和 测，并对 转基因植株进行了遗传分析，对 转基因材料和转基因材料进行了跟踪检测。 关键字：小麦，农杆菌转化，成熟胚，幼胚，幼穗，基因型筛选，分子检测 n of to is is of of by as it is to to of by to to 83 in 154X 54Y. by US by of 9, 611, 1 to US , , 706 to US , . to on it on as US T, 154X, by as be to It at of by as by as CR by of 1 录 第一章 绪论 . 1 麦遗传转化的主要方法 . 2 因枪法介导的小麦转化 . 2 杆菌介导的小麦转化 . 3 它方法介导的小麦转化 . 4 麦农杆菌转化研究现状 . 5 子叶植物农杆菌转化回顾 . 5 麦农杆菌转化研究进展 . 6 响农杆菌法转化小麦的因素 . 7 麦植株生长条件控制 . 8 麦基因型 . 8 植体类型 . 8 杆菌菌株和载体 . 8 种预培养和共培养的条件 . 9 择标记基因 . 10 麦农杆菌转化存在的问题 . 11 研究的意义、主要内容及技术路线 . 12 题意义 . 12 究内容 . 12 术 路线 . 13 第二章 小麦成熟胚农杆菌转化体系研究 .验材枓 . 14 源基因、质粒载体及其农杆菌菌系 . 14 麦材料 . 14 剂及耗材 . 15 器设备 . 16 物 . 16 究方法 . 16 杆菌介导法转化小麦成熟胚 . 16 麦抗性再生植株 取 . 19 粒 . 19 段的回收与纯化 . 20 织化学染色检测 . 20 性再生植株的 . 20 抗性再生植株的 . 21 基因植株的 析 . 21 果与分析 . 22 伤组织诱导结果 . 22 织化学染色结果 . 23 0代转基因植株获得 . 24 0代转基因植株 . 25 1代转基因植株检测和遗传分析 . 27 2代转基因植株跟踪检测 . 28 基因植株 测 . 31 题讨论 . 32 于成熟胚外植体的处理方法和转化效率 . 32 于 果不一致的原因 . 32 1代植株分离比例不符合 3:1 的可能原因 . 33 于高分子量麦谷蛋白亚基基因在小麦中的表达 . 33 第三章 小麦幼胚农杆菌转化体系研究 .验材枓 . 34 源基因、质粒载体及农杆菌菌系 . 34 麦材料 . 35 剂及耗材 . 36 器设备 . 36 物 . 36 究方法 . 36 杆菌介导法转化小麦幼胚 . 36 性再生植株 . 38 织化学染色检测 . 38 性再生植株的 . 38 性再生植株的 . 38 果与分析 . 39 同小麦基因型幼胚农杆菌敏感性差异 . 39 性再生植株获得 . 42 0代抗性再生植株 . 42 论 . 44 于农杆菌敏感性小麦基因型筛选 . 44 于小麦与农杆菌共培养方式 . 44 于诱导愈伤组织培养基的改进 . 45 第四章 小麦幼穗农杆菌转化体系研究 . V 验材枓 . 46 源基因、质粒载体及其农杆菌菌系 . 46 麦材料 . 47 剂及耗材 . 47 器设备 . 47 究方法 . 47 杆菌介导法转化小麦幼穗 . 47 麦植株 . 48 织化学染色检测 . 48 性再生植株的 . 48 果与分析 . 49 伤组织诱导结果 . 49 织化学染色结果 . 49 性再生植株的获得 . 52 性再生植株 测 . 52 题讨论 . 52 第五章 结论 .考文献 . 谢 .者简历 . 文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 膦丝菌素乙酰转移酶 牛血清白蛋白 (第五组分 ) 基对 2,4,42,4联免疫吸附测定法 种抗生素 花莲外源凝集素 潮霉素磷酸转移酶 养基名称 -(2-(乙磺酸 养基名称 萘乙酸 新霉素磷酸转移酶 合酶链式反应 二烷基硫酸钠 羟甲基氨基甲烷和乙二氨四乙酸钠盐 （羟甲基）氨基甲烷 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 组技术的创立使分子生物学研究由理论进入实践，基因工程技术应运而生。在农业生产方面，植物基因工程育种技术为植物产量提高和品质改良开辟了广阔的前景。 20 世纪80年代初 1985年 服了利用植物原生质体、悬 浮细胞等作为外源基因受体所带来的再生困难，直接用 植 物的组织块进行转化大大简化了试验程序。利用这一转化技术，马铃薯、番茄、拟南芥等双子叶模式植物相继转基因获得成功。此后，植物转基因技术迅速发展，先后建立了除农杆菌介导法以外的 导法、电激穿孔法、病毒介导法、基因枪法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等。经过多年的实践和优胜劣汰，多数转化方法已被逐步放弃，形成了以农杆菌介导法和基因枪介导法占主导地位的两大植物转基因体系，通过这两种方法获得成功的报道占转基因总数的 90%，其中农杆菌法获得的转基因植物占转基因 植物总数的 85%左右。农杆菌介导法主要用于双子叶植物，基因枪介导法主要用于单子叶植物。利用农杆菌介导法和基因枪介导法，很多植物的转基因研究获得了成功，涉及 35个科的 50 多个物种，共 120 多种植物。众所周知，世界上一半以上的食物来源于禾谷类作物，而禾谷类作物的遗传转化研究一度进展缓慢。 1988 年 利用基因枪介导法转化玉米悬浮细胞系，获得了可育的转基因植株。 1994 年 以水稻成熟胚愈伤组织和未成熟幼胚为受体，获得了较多有严格分子生物学证据的转基因水稻植株，并对农杆菌介导法转化水稻的影响因素进行 了详细研究，建立了比较成熟的农杆菌转化水稻的技术体系，为农杆菌介导法转化单子叶植物开辟了先河。 随着转基因体系的建立和成熟，科学家们业已将一些功能基因转入了主要农作物，培育了转基因作物新品种，如抗虫转基因棉花、抗除草剂转基因大豆、抗虫转基因玉米、抗除草剂转基因油菜等。自 1986 年转基因植物首次获准进入田间试验、 1994 年转基因番茄在美国批准上市以来， 2000 年全球转基因作物种植面积 4,420 万公顷， 2004 年达 8,100 万公顷， 2005年达 9,000 万公顷，比 2004 年增加了 11%。与 2000 年相比， 2005 年不仅转基因作物种植面积有所增加，而且种 植 的国家也趋向多元化，除美国、阿根廷、加拿大、巴西、中国等种植大国外，巴拉圭、南非、乌拉圭、澳大利亚、印度、罗马尼亚、西班牙、墨西哥、菲律宾、哥伦比亚、保加利亚、洪都拉斯、德国、印度尼西亚、伊朗、葡萄牙、捷克等也有一定种植面积。 据统计， 2005 年全球转基因作物中的 38种植在发展中国家，而且其发展趋势呈现持续增长势头。在发展中国家，人口增长和食物短缺的矛盾日益尖锐，同时伴随着耕地减少、生物种植和生存环境的恶化，转基因技术是解决这些问题的最有效途径。在发达国家，转基 因作物的种植已经产生了巨大的经济效益。 2005 年全球转基因作物的交易额达到 美元，预计 2010 年达 到 100 亿美元。人类对高产优质、抗病抗逆生物的需要，以及对低成本高产出的追求，无疑将促使转基因技术的深入研究和转基因生物的大规模产业化。我国科学家在世中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 2 界上率先将抗虫基因、抗除草剂基因和抗白叶枯病基因导入了水稻，目前正在进行环境释放和生产试验，有望近几年实现产业化生产。 麦遗传转化的主要方法 世界上小麦种植面积约占耕地面积的 17，小麦是人类摄取热量与蛋白质的主要来源之一，还提供重要的维生素和矿 物质，如维生素 B 和 E，含镁和磷的物质，以及纤维类物质。传统小麦育种方法育种周期长，转基因技术的发展为小麦育种提供了一种新的遗传改良手段，并且弥补了传统育种方法的不足，不仅可以增加产量，还可以改良品质，提高抗性。但是在粮食作物中，小麦属于遗传转化最为困难的作物，加上转基因研究起步较晚，基因工程育种进程明显落后于其它作物。在诸多转基因方法中，小麦转基因研究主要采用了基因枪和农杆菌介导两种转化方法。 因枪法介导的小麦转化 基因枪法也称为粒子轰击 (近几年来大量采用的有效方法。其原理是将载有外源 钨（金）等颗粒加速后射入受体细胞，加速的动力是通过火药爆炸或高压气体或高压放电加在粒子上的瞬时冲量，目前主要应用的是压缩气体驱动的基因枪，如以氦气、氢气、氮气等驱动的 1000 系统，影响基因转化的主要因素包括： (1)基因枪轰击参数。如粒子速度，射入深度，阻挡板至样品室高度，轰击次数，上样方式，射弹的理化特性， 纯度及浓度， 亚精胺浓度等。(2)生物因子。如外植体的种类 ，细胞生理状态，轰击前后的培养条件，以及细胞内环境对外源 运的影响等。目前为止，基因枪转化成功的植物已达 20 多种，包括大豆、烟草、水稻、小麦、棉花、玉米、甘蔗等。但基因枪介导法存在转化效率比较低，插入外源 拷贝整合比较多，容易发生基因沉默现象，不能导入大片段 缺点，而且成本高，操作比较复杂。在实际应用中有一定局限性。 1992 年 利用基因枪介导法将 因导入了小麦，获得了世界上第一例小麦转基因植株。 1993 年 、 利用基因枪介导法分别将 因、 因导入了小麦，建立了基因枪法转化小麦的技术体系。在随后的几年内，小麦转基因研究基本上借助 于基因枪介导法。 1994 年 利用基因枪介导法将 因和 因导入了小麦，获得了转基因植株。 1995 年 利用基因枪介导法将 因和 因导入了小麦，获得了转基因植株。 1996 年 、 、 、 利用基因枪介导法分别将 因、 因、 因和 因转入了小麦，完善了基因枪法转化小麦的技术体系。 (1996)、张晓 东等 (1997)、陈梁鸿 (1997)、 (1998)分别利用基因枪法将编码高分子量谷蛋白亚基 因导入了小麦幼胚和幼穗，获得了稳定表达的转基因植株。徐惠君等 (2001)利用基因枪介导法将 制酶基因导入了小麦，徐琼芳等 (2001)、梁辉等 (2004)分别利用基因枪介导法将 因导入了小麦，转基因小麦对黄花叶病毒病、中国农业科学院硕士学位论文 第一章 绪论 3 蚜虫表现较强抗性，目前已进入环境释放阶段。（表 1 表 1因枪法转化小麦情况 w b y bo 外源基因 Ex 转化结果 来源 株 (1992) 株 张 哓 东 等 (1997) 株 a 等 (1996) 植株 (1995) 株 (1992) 株 (1993) 株 (1996) 株 (1993) 株 (1994) 株 y 等 (1996) 株 (1996) 株 (1996) 愈 伤 组 织 (1991) 株 徐 惠 君 等 (2001) 植株 徐 琼 芳 等 (2001) 株 梁 辉 等 (2004) 杆菌介导的小麦转化 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌， 1907 年发现农杆菌是植物致瘤的起因，植物细胞 被侵染后，形成肿瘤。能够诱发冠瘿瘤的称为根癌农杆菌 (诱导毛发状根的称为发根农杆菌 (受感染的细胞可产生正常细胞所不能产生的生物碱冠瘿碱，被农杆菌利用作为自身繁殖所需要的碳源和氮源。致瘤必须有 粒上 因两部分参与。 有 5端和 3端真核表达信号，如 等。 两端左右边界各为 25重复序列，完全保守。尽管 整合进植物基因组中，但 因并不与 转移及整合有关，因为它不编码使移的产物。 移由质粒上的 因区控制。 因区大小为 30括B、 C、 D、 E、 G、