实验七++细菌的药敏试验及耐药性检测

实验七 细菌的药敏试验及耐药性检测【目的和要求】1.掌握纸片扩散法（K-B法）、液体稀释法两种药敏试验的原理和方法。2.熟悉上述两种药敏试验方法的应用。3.了解几种细菌耐药表型检测的原理、方法及意义。【试剂与器材】1培养基：一般需氧和兼性厌氧菌采用水解酪蛋白（M-H）琼脂或M-H液体培养基（pH7.27.4）。对于营养要求高的细菌，则需在M-H培养基中加入其它营养成分。2抗菌药物纸片：直径为6.06.35mm的滤纸片上，含有一定量的某种抗菌药物。市场有售，但生产厂家须获得国家食品药品监督管理局（SFDA）批准。不同种类的待测菌药敏试验选择不同的抗菌药物，药敏纸片的选择见表7-1。3待测细菌 接种普通营养琼脂经351618h的纯培养物。4. 0.5%麦氏比浊管 配制方法如下：0.048mol BaCl2 (1.17% W/V BaCl2 . 2H2O) 0.5ml 0.18mol H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液置冰水浴中冷却后混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。有效期为6个月。5.其它：无菌生理盐水、无菌棉签、无菌试管、酒精灯、镊子、生物安全柜、培养箱等。【实验内容】一、 纸片扩散法（K-B法）药敏试验1原理将含有定量的抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌的琼脂平板表面，纸片上的药物随即溶于琼脂中，并沿纸片周围由高浓度向低浓度扩散，形成逐渐减少的梯度浓度。在纸片周围，一定浓度的药物抑制了细菌的生长从而形成了透明的抑菌环，抑菌环的大小则反映了待测菌对该种药物的敏感程度。K-B法是由Kirby - Bauer 建立，美国NCCLS推荐，目前为世界所公认的标准纸片扩散法（定性法）。2方法（1）培养基的准备：将无菌M-H琼脂加热融化，趁热倾注入无菌的直径90mm平皿中。琼脂厚为4mm（约2325ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4保存，在5日内用完，使用前应在37培养箱放置30min使表面干燥。（2）试验菌液准备：将待测细菌接种于普通琼脂平板，35培养1618h，然后从平板上挑取数个菌落，于23ml无菌生理盐水中混匀后与0.5麦氏比浊管比浊，调整浊度与标准比浊管相同，其细菌浓度相当于108 CFU/ml。（3）细菌接种：用无菌棉拭蘸取已调试的菌液，在管壁上稍加挤压之后，手持棉拭于M-H琼脂表面均匀划线接种，共划3次，每次将平板旋转60角，最后沿平板内缘涂抹一周，盖上平板，室温下置35min待琼脂表面的水分稍干。（4）贴纸片 用无菌镊子夹取药物纸片平贴在种好细菌的琼脂表面，每个平板可贴46种药物纸片。纸片放置要均匀，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平板边缘的距离应不小于15mm。纸片一旦接触琼脂表面，就不能再移动。（5）培养：贴好药物纸片的平板应于室温下放置15min，然后翻转平板，放35培养1824h之后观察结果。3结果观察和报告将平板置于黑背景的明亮处，用卡尺从背面精确测量包括纸片直径在内的抑菌环直径，测得结果以毫米为单位进行记录，最后参照NCCLS的标准（见附录）进行结果判断，并以敏感（sensitivity）、中度敏感（morderate sensitivity）和耐药（resistant）等程度报告之。4注意事项（1）培养基的成分、酸碱度以及平板的厚度等对试验结果都可以造成影响。购买培养基时应考虑其质量，对每批M-H琼脂平板均需用标准菌株检测，合格后方可使用。制备平板时，注意其厚度并且厚薄要均匀。（2）药物纸片的贴放要均匀，并且要充分接触琼脂。药物纸片应始终保存在封闭、冷冻、干燥的环境，否则会影响其活性。长期储存须置-20的冰箱，日常使用或没用完的纸片应及时放4保存，用时须提前12 h取出放室温平衡。纸片应在有效期内使用。（3）菌液浓度也可影响试验的结果，浓度大细菌多时抑菌环减小；菌量少时抑菌环则偏大。此外，菌液配好后应在15min内用完。（4）培养温度以35为宜。平板的堆放不超过2块，防止受热不均。（5）试验过程严格按要求操作，严格无菌操作。（6）抑菌环的测量要仔细、精确。5质量控制：以新鲜传代的金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下用与常规试验相同的方法测定对同种抗菌药物的敏感性，标准菌株的抑菌环应在预期的范围内。如超出了该范围，则不能向临床发报告，应及时查出原因，予以纠正。标准菌株应每周用M-H琼脂传代，4保存。 6临床意义：用于临床细菌常规药敏检测，监测细菌的耐药变迁，指导临床用药。二、 试管稀释法 1原理将待测细菌种于一系列含有不同浓度抗菌药物的液体培养基中，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）或最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration,MBC）。2方法（1）抗菌药物原液的配制：试验用的抗菌药物应为标准的粉剂，选择适宜的溶剂和稀释剂进行溶解和稀释（表7-2），并配成一定浓度（通常为1000U或1000g/ml）的药物原液。原液以过滤法除菌，小量分装使用，放-20以下一般可保存三个月，如果置4只能保存一周。（2）待测菌液的准备：分纯的平板上挑取45个菌落，接种于35ml M-H肉汤中35培养46h，与标准比浊管比浊，校正菌液浓度至0.5麦氏单位之后，再用M-H肉汤按1200稀释，并在15min内接种。（3）试验方法：1）排列试管：取无菌试管1015支排列于试管架上，除第一管外，其余每管加入M-H液体培养基1ml。 2）药物稀释：吸取抗菌药物原液（1000g/ml）5.12ml和液体培养基4.88ml加入一无菌大试管中，充分混合后，从中吸出2ml分别加入第一、第二管中，每管1ml；第二管混匀后吸出1ml加入到第三管，以此类推直至最后一管，从最后一管吸出1ml弃去；经如此稀释，各管的药物浓度依次为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03g/ml；另设培养基对照、待测菌生长对照和质控菌生长对照管。3）细菌接种：将已准备好的菌液分别加入到上述各试验管和对照管中，每管0.05ml，轻轻旋转混匀。4）培养：置35培养1218h后观察结果。3结果判断及报告将试管拿出逐一对光观察，凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。并以MIC报告之。如果以0.01ml容量接种环从无菌生长的试管中移种一环于血琼脂平板上划线作次代培养，经35培养过夜后，观察能杀死99.9%的种入菌的最低药物浓度即为最低杀菌浓度（MBC）。4注意事项（1）培养基的pH、渗透压和电解质均可影响试验结果。（2）抗菌药物必须使用标准粉剂，不应使用口服药而影响其含量。配好后的药物原液应在有效期使用。考虑到抗菌药物的效力，不同药物应选择不同的稀释度。（3）试验过程易污染，应严格无菌操作。（4）结果应在1218h内观察，培养时间过长，被轻度抑制的部分细菌可能会重新生长，由于某些抗菌药物不够稳定，时间长了其抗菌活性也会降低，甚至消失，从而使MIC增高。5质量控制：每次试验应选用金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、粪肠球菌ATCC29212和铜绿假单胞菌ATCC27853等标准菌株在相同条件下作平行试验。如果标准菌株的试验结果超过或低于预期值一个稀释度以上，不应发出临床报告，而应找出差错的原因。6临床意义：多用于抗菌药物抗菌效力的测定，新药开发。目前临床的自动化或半自动化的药敏试验多采用与次类似的微量稀释法。三、部分细菌耐药表型的检测1耐甲氧西林葡萄球菌的检测（头孢西丁纸片扩散法）甲氧西林(methicillin)是一种能耐青霉素酶的半合成青霉素。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)因多了一个由mec基因编码的青霉素结合蛋白（PBP2）而对甲氧西林耐药。这种PBP2不但与内酰胺类抗生素的亲和力极低，而且具有其他高亲合力青霉素结合蛋白(PBPs)的功能。当其他PBPs被内酰胺类抗生素抑制而不能发挥作用时，PBP2可替代它们完成细菌细胞壁的合成，从而使细菌得以生存。MRSA从1961年发现至今几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一。因此，开展对MRSA的检测，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着十分重要的意义。（1）原理：同纸片扩散法。由于头孢西丁和苯唑西林较甲氧西林稳定，不易失活，通常使用这两种药物代替甲氧西林测定葡萄球菌的耐药性。（2）方法：以无菌棉拭蘸取已调试的待测菌液接种于M-H琼脂平板上（同K-B法），再贴上头孢西丁药物纸片（30g/片）或苯唑西林药物纸片（1g/片），将平板置于35培养24h，之后观察结果。（3）结果判断：头孢西丁纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环20mm为敏感，19 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌25 mm为敏感，24 mm为耐药。苯唑西林纸片法：金黄色葡萄球菌抑菌环13 mm为敏感，10 mm为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌18 mm为敏感，17 mm为耐药。（4）注意事项：1）头孢西丁法结果观察时应使用反射光线。苯唑西林纸片法结果需对着透射光线观察，抑菌环内有任何可辨别的细菌生长即为苯唑西林耐药。2）培养温度应为3335，超过35耐药的葡萄球菌可能被抑制不能生长而漏检。2肠杆菌科细菌产超广谱-内酰胺酶的检测超广谱-内酰胺酶（extended -spectrum -lactamase,ESBLs）是指能水解青霉素类和头孢菌素类抗生素并扩展到能水解第三、第四代头孢菌素以及单环类抗生素并由质粒介导的-内酰胺酶。自1983年德国首次发现报道以来，在全世界ESBLs检出率呈现出不断上升的趋势。并具有多重耐药和转移迅速等特点，极易导致院内交叉感染和耐药菌的扩散。产生ESBLs的细菌主要是大肠埃希氏菌、肺炎克雷白氏菌、阴沟肠杆菌，其他如铜绿假单胞菌、变形杆菌属及不动杆菌属也可产生。对ESBLs有多种方法可以进行检测，目前主要采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）所推荐的纸片扩散法、稀释法，并分筛选实验和确认实验两步进行。（1）筛选试验（纸片扩散法）1）药物纸片：头孢泊肟(Cefprozil,CPD)10g/片 或头孢他啶(Ceftazidime,CAZ) 30g/片 或氨曲南(Aztreonam,ATM) 30g/片 或头孢噻肟(Cefotaxime,CTX) 30g/片 或头孢曲松(Ceftriaxone,CRO) 30g/片） 2）方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于M-H琼脂平板上，稍干后，在琼脂培养基表面贴上头孢他啶等药物纸片（同K-B法），之后放35温箱中培养16-18h观察结果。3）结果判断： 头孢泊肟抑菌环直径17mm 头孢他啶抑菌环直径22mm 氨曲南抑菌环直径27mm 头孢噻肟抑菌环直径27mm 头孢曲松抑菌环直径25mm符合以上任何一项即可认为该菌能产ESBLs。4）质量控制：以大肠埃希菌ATCC25922做质控，其抑菌环直径应符合CLSI质控范围。以肺炎克雷伯菌ATCC700603做质控，其抑菌环直径应符合以下要求：头孢泊肟抑菌环直径916mm头孢他啶抑菌环直径1018mm氨曲南抑菌环直径917mm头孢噻肟抑菌环直径1725mm头孢曲松抑菌环直径1624mm（2）表型确证试验（双纸片增效法）1）原理：克拉维酸可与多数-内酰胺酶牢固结合，生成不可逆的结合物，为一种非常有效的抑制剂。在同一平板上贴加克拉维酸纸片，可以抑制细菌-内酰胺酶的作用，从而使头孢他啶等抗菌药物的抑菌环增大。2）药敏纸片：头孢他啶（30g/片）克拉维酸（Clavulanic Acid，CLA，10g/片）头孢噻肟（30g/片）3）方法：将0.5麦氏单位的待检菌液涂抹于MH琼脂平板上（同K-B法），稍干后，在琼脂培养基表面分别贴上头孢他啶和头孢他啶/克拉维酸，头孢噻肟和头孢噻肟/克拉维酸纸片，置351618h培养后量取抑菌环直径。4）结果判断：与单纸片平皿对照，两种药物中的任何一种若加克拉维酸纸片较未加克拉维酸纸片抑菌环直径5mm，即为ESBL阳性。 5）质量控制以大肠埃希菌ATCC25922所测试药物联合克拉维酸后的抑菌环直径与单药抑菌环相比，增大值2mm 。肺炎克雷伯菌ATCC700603：头孢他啶/卡拉维酸抑菌环直径应增大5mm；头孢噻肟/克拉维酸抑菌环直径应增大3mm。【结果记录和报告】表7-1 非苛氧菌常规试验和报告中应考虑的抗微生物药物推荐分组肠杆菌科细菌铜绿假单胞菌葡萄球菌属肠球菌属A组一级试验并常规报告的药物氨苄西林头孢他啶苯唑西林青霉素 或 氨苄西林头孢唑啉头孢噻吩庆大霉素青霉素美洛西林或替卡西林哌拉西林庆大霉素B组一级试验有选择报告的药物阿米卡星阿米卡星阿奇霉素 或克拉霉素 或红霉素达托霉素阿莫西林/克拉维酸 或氨苄西林/舒巴坦哌拉西林/他唑巴坦替卡西/克拉克维酸氨曲南头孢哌酮克林霉素利奈唑胺达托霉素头孢孟多 或头孢尼西或头孢呋辛利奈唑胺奎奴普汀/达福普汀泰利霉素头孢吡肟头孢吡肟甲氧苄啶/磺胺甲噁唑头孢美唑头孢哌酮头孢替坦头孢西丁环丙沙星左氧氟沙星万古霉素万古霉素亚胺培南美洛培南头孢噻肟 或头孢唑肟 或头孢曲松厄他培南亚胺培南或美洛培南妥布霉素美洛西林或哌拉西林替卡西林甲氧苄啶/磺胺甲噁唑C组补充试验有选择报告的药物氨曲南头孢他啶奈替米星氯霉素庆大霉素环丙沙星 或左氧氟沙星加替米星或莫西沙星链霉素氯霉素氯霉素红霉素四环素利福平卡那霉素奈替米星四环素奎奴普汀/达福普汀妥布霉素庆大霉素利福平四环素U组补充试验有选择报告的药物羧苄西林羧苄西林美罗沙星或诺氟沙星环丙沙星左氧氟沙星诺氟沙星西诺沙星 或诺氟沙星或氧氟沙星罗美沙星 或 诺氟沙星 或氧氟沙星呋喃妥因呋喃妥因加替沙星磺胺异噁唑四环素氯碳头孢甲氧苄啶呋喃妥因磺胺异噁唑甲氧苄啶/磺胺甲噁唑注：试验常规抗菌药物选择 在标准中分成A、B、C、U四组：A组所列的抗生素为常规首选药敏试验药物。B组为临床使用的主要抗生素,尤其在医院感染时使用的抗生素，可在下列情况下使用：对A组同类抗生素耐药；标本来源不同时，如三代头孢菌素使用于脑脊液中的肠杆菌，磺胺甲恶唑使用于尿道分离的细菌；多种微生物感染；多部位感染；感染流行的控制；对A组抗生素过敏、耐受或无反应。C组药物用于对A组药物耐药的流行菌株或对A组药物过敏的病人和某些不常见的细菌（如肠外分离的沙门菌属或耐万古霉素肠球菌）。U组仅用于尿道中分离的细菌，不作为尿道外分离菌的常规药敏试验。 表7-2 常见抗菌药物原液的溶剂及稀释剂 抗生素 溶