原核表达及检测.doc

原核表达及检测摘 要：本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况 关键词：原核表达 SDS-PAGE凝胶电泳 广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。因为只有融合体蛋白才具有生物活性，所以还要进行融合体/包涵体检测。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。 绿色荧光蛋白 ( green fl uorescent protei n, GFP)是 238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来 1, 并且 Prasher等在 1992年从水母 Aequoreavictoria中成功克隆出了 GFP的 cDNA 2 。GFP作为一种新的报告基因,与以往 lacZ、 CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外 GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。 SDS-PAGE的原理：组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,NN-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。蛋白质在凝胶中受电场的作用而发生迁移，不同种蛋白在凝胶的网状结构中迁移的速率不同，其速率取决于蛋白质所带电荷的多少和蛋白质的大小和形状。根据迁移速率的不同，可将不同的蛋白质进行分离。SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量。而与其所带电荷的性质无关。1 材料与方法1.1 材料1.1.1经过双酶切鉴定的阳性单克隆菌落先前实验保存下来的1.1.2主要试剂：Amp（100mg/ml）IPTG（异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷） 30%Acr-Bis(291) TEMED溴酚蓝LB培养基（液体）1SDS-PAGE loading buffer（配制5SDS-PAGE Loading Buffer ，用时稀释）1 M Tris-HCl (pH6.8)1.5M Tris-Hcl(Ph8.8) 10%SDS 10%过硫酸铵1Tris-Gly电泳缓冲液（配5Tris-Glycine电泳缓冲液，用时稀释）20%的乙醇PBS buffer 50mmol/L Tris-HCl100m M醋酸钠（PH4.5）标准蛋白质。1.1.3 主要仪器：超菌工作台、分光光度计、摇床、离心机、恒温加热器、漩涡器、电泳槽、记号笔、标签纸、三角瓶、玻璃棒、报纸若干、移液枪（1000l 、200l 、20l ）及对应的枪头若干、离心管（2ml、1.5ml）、烧杯（100ml、1000ml）各两个。1.2方法1.2.1鉴定目的蛋白是否在单克隆大肠杆菌中大量表达 1）挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700l LB培养基，加入0.7g Amp（100mg/ml），37200r/min摇床培养，过夜活化。 2）按150比例（200l），将活化的过夜培养物加入10ml LB液体培养基中，加入10g Amp（100mg/ml），37200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液的OD600在0.6-1.0（最好0.6，大约需3hr），以使大肠杆菌处于最适合表达蛋白的生长状态。 3）从10ml扩大培养物中取出3ml菌液作为不加IPTG的空白对照，余下的7ml加入7l IPTG诱导剂（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG终浓度0.5mM，两组继续37200r/min震荡培养3h。 4）以5000r/min离心2min收集菌体，倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5)加入1ml dH2O,将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，倒上清。 6)重复上一步骤，将离心管的液体全部倒清。 7)在紫外灯下照射，观察GFP随时间变化的表达量。1.2.2鉴定目的蛋白是包涵体还是可溶性蛋白 1 从冻存菌液中取10l，接种于5ml的LB培养基中，加入50lAmp（mg/ml），过夜活化菌株。1. 按照1:50的比例，从活化菌种中，取1ml的菌液接种于50mlLB培养基中，加入50lAmp（mg/ml），扩大培养3h。2. 扩大后的菌液，取出10ml，不加IPTG,作为空白对照，剩余40ml菌液中加入40lIPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37,200rpm的条件下培养3h。3. 用50ml的离心管收集菌体，8000rpm离心，离心3min，注意配平。4. 倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌液体一遍，12000rpm离心2min。注意将菌体充分打散。5. 倒掉上清，用枪头将上清吸干净，根据菌体的浓度，加入适量的PBS buffer 悬浮菌体。6. 用大功率的超声波将菌液破碎，期间超声波每工作2min，停止1min。菌体始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白质不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。7. 12000rpm，离心3min，分离上清和沉淀。8. 在沉淀中加入250l 1SDS Loading buffer，取200l 上清，加入50l 5SDS Loading buffer，在恒温加热器上100加热10min。9. 加样后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。10. 取上清40l点样，按照一下的方法进行SDS-PAGE检测。11.制胶 a.根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶（我们的蛋白分子量大约27kDa）蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（%）4-402012-451510-701215-1001025-2008分离胶配方15%12%8%ddH2O3.4 ml4.9 ml6.9 ml30%Acr-Bis(291)7.5 ml6.0 ml4.0 ml1.5M Tris-Hcl(Ph8.8)3.8 ml3.8ml3.8 ml10%SDS150 ml150 ml150 ml10%过硫酸铵150 ml150 ml150 mlTEMED20 ml20 ml20 ml总体积15 ml15 ml15 ml 按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后，用1ml H2O封住分离胶液面，在室温（37）凝胶30min，至分离胶与水之间出现一条明亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。 b.制作浓缩胶浓缩胶配方5%ddH2O3.4l30%Acr-Bis(291)0.85l1.5M Tris-Hcl(Ph8.8)0.63l10%SDS50l10%过硫酸铵50lTEMED20l总体积5ml胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温凝胶30min。 12.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1Tris-Gly电泳缓冲液没过点孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极。 13.Marker点5l，用10l小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压70V，保证电流在20mA-30 mA之间，当样品跑入浓缩胶时适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。点样顺序是：对照的上清，沉淀，样品的上清，沉淀。14.根据SDS-PAGE检测结果，判断目的蛋白是包涵体还是以可溶性的蛋白产生。如果蛋白在上清中表达，则形成包涵体，需要改变诱导表达条件，比如将扩大培养与诱导的温度改为25并延长相应培养时间。如果蛋白在上清中表达，则形成可溶性蛋白，可继续下一步实验。1.2.3 SDS-PAGE 1)将诱导3小时的菌落中加入200l 1SDS-PAGE loading buffer。用漩涡器剧烈震荡，确保管底沉淀震散。 2)将样品于100恒温加热器上开盖加热10min（Marker也加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，用每管的上清点样，上样量一般30l -40l，marker20l。 3)制胶参照1.1.2步骤11 4)胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1Tris-Gly电泳缓冲液没过点孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极。 5)Marker点5l，用10l小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压70V，保证电流在20mA-30 mA之间，当样品跑入浓缩胶时适当调高电压，但不宜多次调整电压，否则条带会跑歪。 6)当溴酚蓝电泳至胶槽底部时，一般需2.5h，停止电泳，剥胶，将浓缩胶部分切除后，加入考马斯亮蓝染色液，40r/min染色3h，可以过夜染色。 7)用移液器回收考马斯亮蓝染色液，再用蒸馏水将浮色冲洗干净后，倒入考马斯亮蓝脱色液，40r/min脱色至胶背景透明，期间可每2h更换一次脱色液。 8)根据菌落SDS-PAGE的结果，可以看到目的蛋白是否大量表达。2 结果2.1 鉴定目的蛋白是否在单克隆大肠杆菌中大量表达见图1 图1由图1可知随着时间的推移GFP的表达量越来越多。2.2 鉴定目的蛋白是包涵体还是可溶性蛋白见图2 沉淀Ma