【毕业学位论文】（Word原稿）三个与水稻株型相关突变体的鉴定与基因克隆生物化学与分子生物学博士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 三个与水稻株型相关突变体的鉴定 与基因克隆 I 摘 要 随着水稻基因组测序计划的全面完成，阐明基因的生物学功能成为后基因组时代的重要研究内 容，而水稻的株型是构成产量的主要因素，对水稻株型发育的分子机理的了解可以为育种提供理论基础。我们从 入水稻突变体库中，筛选到三个与株型相关的突变体 :短穗大叶角 茎秆螺旋 并对这 3个突变体进行了形态学鉴定、遗传分析和初步的生理学研究，克隆了 要结果如下： 1. 现为半矮化、穗型短而密 集、叶片窄、抽穗延迟等特点， 且 花器官数目增加，结实率低，穗轴和枝梗伸长受到抑制，该 突变体 属于 发现 突变体对 温度敏感；遗传分析证实 稳定遗传的且受一对不完全显性核基因控制； 对照植株用生型植株的株高 7%，而 步确定 2. 对 变体自交和杂交后代植株进行 性分析，并用 交证明用 中 果 入到 第 5染色体的 一个同源异型盒转录因子基因中； 对 码产物进行了同源性分析；用 析了的器官表达，表明、叶、穗中 呈组成型 表达； 3. 利用酵母自激活研究了转录因子 激活功能， 以成功激活报告基因的表达；研究了其他禾谷类作物是否 具 果野生稻中含有该同源基因，而小麦、玉米、高粱、甘蔗无明显的同源基因；构建了 载体，遗传转化正在进行； 4. 对 变体的特征进行了 鉴定 ， 株半矮化、叶角度大、叶片微卷和抽穗期延迟，突变体矮化类型也属于 稳定遗传且受一对隐性核基因控制； 一染色体的 一个 据已有报道，将该基因命名为 对 明 根、茎、叶、穗中 呈组成型 表达；用 行亚细胞定位表明 5. 对 变体进行了鉴定，突变体苗期叶鞘弯曲、螺旋生长，分蘖期表现为分蘖角度变大、半矮化、迟抽穗、育性较差等特点；苗期取弯曲生长的叶鞘进行石蜡切片，发现弯曲部位的细胞排列紧密； 性分析表明突变体与 是共分离。 关键词 水稻，株型， 签，基因克隆 of of in in of to , of as 1. p2 p2 by a A3 at p2 to 2. p2 in a in . in 3. RF in of in 4. by A3 at to A3 at in t to of by a in a in . LA in in 5. at at of at in in as a of by a 录 摘 要 . I . 要符号表 . 一部分 文献综述 . 1 第一章 水稻中的 签 . 1 . 1 . 1 . 2 . 2 . 2 签基因的分离 . 3 . 3 . 4 第二章 水稻株型发育的分子生物学研究进展 . 5 . 5 . 5 . 5 . 5 . 6 . 8 . 9 第三章 植物中的转录因子 . 10 . 10 . 10 . 10 录因子 . 10 . 11 . 11 . 12 . 12 . 12 第四章 植物中的反向遗传学 . 14 . 14 . 14 义 作用机理 . 14 义 应用 . 14 . 15 . 15 . 15 . 16 V . 16 因打靶概述 . 16 因打靶的操作步骤 . 16 因打靶在植物中的应用 . 17 . 18 术的问世 . 18 术的操作过程 . 18 术的特点与优势 . 19 术的应用 . 20 结 语 . 21 第五章 本研究的目的和意义 . 22 第二部分 研究论文 . 23 第一章 水稻短穗突变体的鉴定与基因克隆 . 23 . 23 . 24 . 24 . 24 . 25 . 25 . 25 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 26 . 27 交 . 27 . 27 . 27 . 28 . 28 . 29 . 30 . 30 . 30 . 30 . 35 . 35 . 36 . 36 . 38 . 42 共分离的分子生物学证据 . 43 . 44 . 46 . 46 . 49 . 49 . 52 . 52 . 53 . 53 . 53 . 54 第二章 大叶角突变体的鉴定与基因克隆 . 55 言 . 55 . 55 料和方法 . 55 . 56 . 56 . 56 . 56 . 56 . 57 . 57 . 57 . 57 果与分析 . 58 . 58 . 60 . 61 . 62 . 63 . 64 . 65 . 66 亚细胞定位 . 67 论 . 69 与植物的发育调节 . 69 . 69 . 69 第三章 茎杆螺旋突变体的鉴定与遗传分析 . 70 . 70 . 70 . 70 组织切片 . 71 . 71 . 71 . 71 . 71 . 74 . 75 . 76 . 76 . 76 . 77 . 77 . 77 结 论 . 78 参考文献 . 79 附录 1 基本实验方法 . 96 附录 2 主要试剂及 培养基的配方 . 103 致 谢 . 106 作者简历 . 107 要符号表 菌人工染色体 基对 补 摩尔根 乙基焦碳酸盐 氧核糖核苷三磷酸 (4 种 ) 巯基苏糖醇 肠杆菌 二胺四乙酸 潮霉素磷酸转移酶 霉素 丙基 那霉素 碱基 B 培养基 碱基 升 尔 开放阅读框 1于 人工染色体 丙烯酰胺凝胶电流 合酶链式反应 机扩增多态性 稻基因组研究计划 NA 涉 分钟转速 二烷基肌酸钠 二烷基磺酸钠 准柠檬酸钠盐溶液 度不对称 NA 热水生菌 合酶 43 移 转录 国农业科学院博士学位论文 第一章 水稻中的 签 1 第一部分 文献综述 第一章 水稻中的 签 言 随着水稻基因组测序计划的全面完成（ Yu et 002;et 002； et 002; et 002），以研究基因的生物学功能为标志的功能基因组学研究成为后基因组时代的核心任务。功能基因组学主要是在基因组水平上全面分析基因的生物学功能和他们之间的相互关系，以及在植物生长发育、代谢、环境应答等过程的时空特异表达及调控机制。与结构基因组学不同，功能基因组学是对基因及其功能进行研究，一旦获得基因的部分或全部信息，研究者即可就该基因申请相关的专利。水稻的基因数目是有限的，在基因的巨大商业前景和应用价值的驱使下，各国政府 和商业公司纷纷斥巨资投入对水稻功能基因组学的研究，分离具重要农艺性状（如高产、优质及抗逆性等）的基因成为投资者的基本目标之一。 变体库的构建 突变体是遗传学研究的基础材料，综观遗传学的发展历程，从遗传学三大规律的发现到现代农业生产上的两次绿色革命的引发，都与突变体的发现和利用密切相关，随着后基因组时代的到来，建立饱和的突变体库成为水稻功能基因组学研究的必要组成部分。目前，水稻突变体库的构建主要有以下方法：（ 1）自发突变，由于自发突变频率低，很难获得饱和的突变群体。（ 2）理化诱变，利用各种射线或化学诱 变剂处理种子或幼苗，这类突变较容易获得饱和的突变体，目前应用比较成熟，但容易使染色体造成大量的畸变，突变的随机性使随后的基因分析与克隆带来很大的困难。（ 3）基因标签法，将 转座子或转座子导入水稻中获得插入的突变群体，用于随后的正向和反向遗传学研究。其中， 利用玉米的转座子 s 构建水稻插入突变体库也是应用较多的方法之一。 验室利用 ,000多个插入的水稻突变体库（ ， et 1999），中科院上海植生所 和中国水稻研究所利用 ,000多株插入群体，并正在进行突变体库的后续分析（王江等， 2000；朱正歌， 2001； et 2003）。近年来，众多研究机构构建了大量的转座子突变体库（ et 1999； et 2001; et 2001； et 2004； et 2004； et 2004; et 2004; et 2004），并有利用转座子克 隆水稻新基因的报道（ et 2003; et 2005）。但是总体来说这些标签系统没有达到预想的效果。 日本的 2,000个个体的 et 1996； et 1997; et 2000; et 2001），并利用该群体分离了包括 et 2001；et 2001； et 2001； et 2003； et 2004 ）。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 水稻中的 签 2 由于 签法在包括拟南芥在内的众多植物中获得了巨大成功，近年来水稻中也构建了大量的 文就 签 述 位于农杆菌内 Ti( Ri(粒上的一段 可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物核基因组中， 插入特点 由于 合的模式比较复杂，因此对 入特点的充分了解将有利于对突变体库作系统研究。目前了解的插入特点主要表现在以下方面 : 首先， 初的研究结果表明， 最近研究显示， 合到染色体 会引起染色体重排（ et 998;et 999; et 000; et 002），当基因组中导入大片段的外源 发生大范围的染色体重组（ et 005），这些特点为随后的突变体分析带来相应的困难； 其次， 入的偏好性。其一是对宿主基因表达区域的偏好性，最初的双子叶植物研究表明， et 1994； et 2000）。近来的研究表明， et 2002; et 002），最近对水稻的研究也发现， 一特点使得构建饱和突变体库所需的群体大大缩小（ et 000; et 001； et 000 ； et 003； et 004）；其二是 期研究认为 随机 整合到基因组 中。但随后在拟南芥中的研究证明 、 3调节区和内含子区域（ et 2002， et 2002），对水稻中插入的 究结果得出类似结论， 00 5、 3调节区和内含子中（ et 1997； et 003；et 004）。同时，对 前已有初步结论， et 002），对水稻插入突变体的旁侧序列分析表明， 合位点处的基因组 界有小部分的同源性（ et 004）。 最后， 多的研究结果表明， 且并非所有的位点 中 有部分或整个载体序列整合进基因组中，甚至存在多拷贝的串联重复（ et 004; et 004）。 中国农业科学院博士学位论文 第一章 水稻中的 签 3 上述特点的存在增加了 基因表达影响的复杂性，很大程度上不利于后代的功能分析。 签基因的分离 分离 1） 质粒拯救法。直接通过内切酶酶切突变体染色体 接、环化、转化细菌，筛选出含 et 992;）； 2） 基于 根据 选突变体的基因文库，再以筛选到的突变体的克隆部分序列为探针筛选野生型的基因文库，从而获得 完整基因的克隆； 3） 基于 已知 过反向 et 1990）， et 1995）等方法扩增 以扩增出的旁侧序列为探针或进一步设计引物筛选野生型基因文库，即可得到与突变相应的完整基因的克隆。通过将克隆到的基因转化突变体，进行功能互补试验从而验证基因的功能。其中 签的改进 传统的 签策略在鉴定胚胎早期易发生致死突变的发育基因，以及研究微效多基因及基因间的补偿作用时明显存在不足。因此，需要发展新的