【毕业学位论文】（Word原稿）β2肾上腺素受体基因的克隆及表达动物营养与饲料科学硕士论文

密级 论文编号 中国农业科学院 学位论文 2肾上腺素受体基因的克隆及表达 2 o. 2 摘 要 畜产品安全问题越来越成为社会关注的的焦点问题。盐酸克仑特罗、莱克多巴胺等 2激动剂在饲喂家畜过程中的滥用，使这些物质在动物内脏、肌肉组织大量积累。这些畜产品加工的食物直接影响人的健康。建立多残留的快速检测技术，对我国这样一个养殖量巨大、养殖单元小的国家十分迫切。 2 肾上腺素受体（ 2一种具有 7 个螺旋结构的整合膜蛋白。天然激素或人工合成的 2 激动剂与 2异性结合后，能引发细胞内一系列生理变化。本研究的目的是克隆 2因，在大肠杆菌中表达 2白，为建立测定多组分 2 激动剂的残留检测方 法进行基础研究。 本研究从大仓鼠的肺细胞组织总 ，用特异性引物，通过 方法扩增得到 2因全序列。测序结果表明，该基因与 报道的 5 种动物的 2 96%的同源性，表明该基因属于 2族成员，大仓鼠 2因序列长度为1254码 417 个氨基酸。 本研究将 2长基因（ 2 N 端和（或） C 端截短的 4 个不同长度的片段（2 2 2 2 C 端通过 建有 6签的两个长度 的片段（ 2 2建到表达载体 ，转化大肠杆菌 后，经 导与 测发现 合蛋白在体外能够表达。蛋白质印迹实验进一步确认了受体蛋白在体外的表达。 在原核表达的分析基础上，将 2建到毕赤酵母表达载体 ，以建立酵母表达系统。已完成了 4 个表达载体的构建，分别为： 序结果证实 2 因片段已正确插入表达载体中，为在毕赤酵母中表达 2造了条件。 关键词 ：大仓鼠， 2 肾上腺素受体基因，克隆，表达 he of by As in in of of in is a 2 to of 2 or a of at AR on is to 2 of in by of in by of In 2AR NA of as a of 96% in to 254 bp 17 In AR . in in of ST on 2AR to of AR 2AR in 2 目 录 第一章 引言 . .1 肾上腺素受体 激动剂的研究进展 1 肾上腺素受体 (研究进展 . . 3 G 蛋白偶联受体表达的 研究进展 . .研究内容和技术路线 . . .本研究的目的和意义 . . 11 第二章 试验材料与方法 . . .试验材料与试剂 . 12 仪器与设备 . . . 13 研究方法 . . . . 13 第三章 试验研究与结果分析 . . 27 大仓鼠 2 肾上腺素受体（ 2因的克隆 2 7 2 肾上腺素受体（ 2因表达载体的构建 .3 4 2肾上腺素受体（ 2基因的体外表达 .四章 讨论 . 论 . . . 51 参考文献 . 52致 谢 . 57作者简历 . 58 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 1 第一章 引 言 肾上腺素受体激动剂的研究进展 肾上腺素受体激动剂的化学结构及作用机理 肾上腺素受体激动剂 (简称 激动剂 ) 是一类天然儿茶酚胺（如：肾上腺素（ 衍生合成的一类化合物。 激动剂一般可分为两大类： 1）含取代基的苯胺型：如克仑特罗（ 和西马特罗（ 化合物。 2）含取代基的苯酚型：如沙丁胺醇（ 特布他林（ 化合 物。 图 1出了两类激动剂中有代表性的化合物结构。这些化合物在侧链上都有共同的 亚氨基团（ 六元芳香环；它们的区别在于苯环部分和亚氨基有不同的取代基。 2 3 激动剂 ) 上腺素 ) 丙肾上腺素 ) 羟甲苯肾上腺素 ) 布他林 ) 诺特罗 ) 克多巴胺 ) 丁胺醇 ) 布特罗 ) 马特罗 ) 仑特罗 ) - 布特罗 ) 图 1 1he 论是合成的激动剂（如：克仑特罗）还是 肾上腺髓质分泌的天然激素（如：肾上腺素），中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 2 都是通过与细胞膜上 肾上腺素受体（ （简称 合，来启动一系列生化反应的。激动剂与 结合使 象发生变化，激动剂 R 复合物与 G 蛋白发生偶联，激活的 G 蛋白（ 与腺苷酸环化酶（ 联。激活的 三磷酸腺苷（ 转化为 3,5。 而激活蛋白激酶（ 或在磷酸二酯酶（ 作用下自身失活 诱发酶磷酸化反应，触发生理反应。激活的 产生以下效应：心率加快，支气管、子宫和肠道平滑肌松弛，促进胰岛素释放和 糖原分解等。 激动剂在动物饲料中的应用 激动剂最初只是应用于医学，属于拟交感神经作用药物，能兴奋支气管平滑肌的 2 肾上腺素受体（简称 2使平滑肌松弛，支气管扩张，用来治疗支气管哮喘病（孙毓秀， 1996）。1965 年 表数据表明：咖啡因、茶碱、烟碱和 肾上腺素等药物有可能改变哺乳动物的生长，它们可以直接或间接通过改变细胞膜的 度来发挥作用。 80 年代初期，美国司发表了用克仑特罗喂饲动物促进生长的文章（ et 1984）。研究 者通过对类似肾上腺素物质的大量筛选和对猪、鸡、牛、羊、鱼等的动物试验，把 激动剂引入到畜禽饲养领域中。 80 年代以后， 2 激动剂在畜禽饲养领域中得到了应用，最为常用的有： 克仑特罗 、莱克多巴胺、沙丁胺醇 、西马特罗等 (王若军， 1994)。 由于激动剂对动物具有促进肌肉生长，减少胴体脂肪含量，改善生产性能等功能，因此 激动剂后来又被称为营养重分配剂，俗称瘦肉精。 90 年代前后， 随着 激动剂在畜牧业中的应用， 激动剂在饲养中的负效应开始被人们所关注。 激动剂产生的负效应有： 1）对动物生理产生不良作用，如：发现猪服用 激动剂后出现非病态的心率加快、血压升高、血管扩张、呼吸加剧、心脏和肾脏负担加重等现象； 2）肉品质降低，口感变劣； 3）停药后脂肪迅速补偿性沉积； 4）动物对环境的调节能力降低等（屈健， 1998；朱爱民， 1996；王彦文， 1995）。更为严重的是，大量服用 激动剂，在动物组织中存在大量残留，其中：眼睛中残留量最高，其次是肝脏、肾脏、脾脏、毛发（杨志凌 ,2003）。 由于数倍于治疗剂量的使用 激动剂， 90 年代后在世界范围内发生多次消费者食用含有 2激动剂类药物较多的肉品，导致集体中毒的事件。 1990 年首次报道了西班牙中部 135 人由于食用了被克仑特罗污染的牛肝而集体中毒的事件。随后欧洲发生多起食用被 激动剂污染的食物中毒事件（ 992； 991； 995）。近年来，我国也发生多起 食用被克仑特罗等 激动剂污染的食物而导致中毒的事件，如： 2002 年江苏苏州发生 26 人食用污染猪肝的中毒事件， 2003 年广东佛山市顺德区近 100 余人和辽宁辽阳市 39 人食用污染猪肉的中毒事件等。 所以，鉴于 激动剂 在 饲养中的负效应和它大量使用后在 动物体内的残留问题，欧盟已 经禁止使用 2 激动剂 作为动物生长促进剂。 1997 年我国农业部、卫生部和国家医药管理局共同发布了 176 号公告，禁止在饲料和动物饮水中使用 2 激动剂。 但是由于经济利益的驱使，违法滥用的现象仍然存在，中毒事件时有发生 (杨曙明， 2003)。 激动剂的残留检测技术 激动剂的残留检测方法的研究，国外有许多报道。 1996 年对生物基质中 激动剂的检测方法有详细的综述（常碧影等， 2002）。欧盟也建立了测定生物样品或动物饲料中 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 3 激动剂单一组分或多组分的筛选方法（ 确证方法（ S， S）。我国于 2001 年建立了饲料、动物组织中盐酸克仑特罗的测定方法。但是多组分残留检测技术还远远滞后于国外水平。 目前用于检测 激动剂的方法主要分两大类。一类为确证方法，有 S， S，S 等 (孙远明 ,2002；谷峰 ,2002)。通过质谱检测器对 激动剂类化合物结构特征的分析，来确认残留物的存在。另一类为筛选检测方法。主要是放射免疫分析法（ 酶联免疫分析法（ （陈勇等， 2002）。 中的 法，由于其具有简捷，快 速、省时、灵敏度高等优点，近年来得到了广泛的应用，在大量样品筛选工作中发挥重要的作用。 析法的局限性有： 1）在测定过程中由于多种原因会产生一定比例的假阳性。 2）每一种 针对一种 激动剂化合物的，不适用于多组分残留检测。 受体分析法是近年来提出的一种适用于多组分残留检测的方法，但由于其技术难度大，目前国内外还未有商品化的产品用于检测工作。在研究初期，受体的获得是通过生物分离技术。分离动物体内细胞膜上受体的办法来获得与 激动剂特异性结合的 于天然 非常低，提取和纯化工作难度大， 且细胞膜上常常是同时存在着多种不同亚类的 以无法分离得到一种单一亚类的 使得受体分析法发展缓慢。随着分子克隆技术的发展，多种动物的 外高效表达 为可能。本研究旨在通过克隆和体外表达技术得到 2 建立测定多组分 2 激动剂的残留检测方法进行基础研究。 肾上腺素受体（ 研究进展 图 1肾上腺素受体 1 结构 图 1镶 嵌于细胞膜脂质双层中的整合糖蛋白， 64跨在靶细胞的细胞膜上，具有 G 蛋白偶联受体的共性。 它在细胞膜上的排列结构可以看到三个显著特征：中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 4 1） 7 个平行排列的跨膜螺旋结构，每个螺旋均由 20疏水氨基酸残基组成，这个区域的氨基酸残基同源性和序列保守性最高； 2） N 端含两个糖基化位点和三个亲水性联结环位于细胞膜外； 3） C 端和三个亲水性环状序列位于细胞膜内侧，其中 C 端富含丝氨酸和苏氨酸残基，构成潜在的磷酸化调节位点。肾上腺素的结合位点处于跨膜螺旋所形成的一个“口袋”内。 功能域 跨膜结构域 在 G 蛋白偶联受体中， 7 个跨膜域中氨基酸的同源性和保守性最高，目前认为这些跨膜域共同参与形成一个“口袋”状配基结合位点，任何一个跨膜结构或其与膜外侧环状之间的联结序列缺失或突变，均可影响 折叠，如位于，螺旋上的第 274氨基酸缺失的仓鼠 2突变受体不能与配基结合，但膜两侧的亲水性环状区氨基酸缺失的突变受体一般不改变配基结合特性。可见这些跨膜结构为维持 级结构所必需，且构成了配基结合位点。用胰蛋白酶处理 125亲和标记的仓鼠 2 现其烷基化共价结合位点位于第条螺旋的 基上。第、和条螺旋上的个别氨基酸残基的改变，也会显著地影响配基结合特性，如位于第螺旋上的 代后，与激动剂的亲和力下降，但不影响拮抗剂的结合能力；位于第螺旋上的 代后，对激动剂和拮抗剂的亲和力均下降 （ ， 1987）。 基在所有的以具有潜在质子化的氨基化合物为特异配基的受体中呈高度保守性，说明酸性氨基酸侧链可能与质子化的氨基阳离子配基 形成离子键结合。 激动剂 分子是含有儿茶酚结构的一类物质，其中的酚羟基可能与第、螺旋上的 链上的羟基形成氢键结合， 激动剂 分子中的苯环结构可与第、螺旋中的 疏水侧链形成疏水键结合。 某些跨膜结构中也呈高度保守，它们可诱导跨膜螺旋结构发生弯折，与其他氨基酸残基 激动剂 结合位点 (， 1997； ， 2001)。 氨基端和膜外侧结构域 N 端有两个典型的糖基化位点 有糖基，并对内切糖苷酶 F 敏感，这些寡糖基链不参与受体与配基的识别和结合过程，但能增加受体的分子量，影响受体蛋白的折叠，促进新生受体插入细胞膜。此外，受体糖基化可以保护受体分子免受蛋白酶作用而过早降解。G 蛋白偶联受体含有 10胱氨酸残基，位于第一外侧环上 第二个外侧环上 蛋白偶联受体中是绝对保守的，它们在两个外侧环之间形成二硫键，对维持受体三 级结构有重要作用，若被其他氨基酸取代，可使受体结合特性发生显著变化。第二外侧环上的第 179氨基酸残基缺失的仓鼠 2 突变受体，不能形成二硫键，从而导致配基与突变受体亲和力的降低。对于 激动剂 和 结合位点和作用机理的研究对更好的利用受体提供了依据。 羧基端和膜内侧结构域 细胞膜内侧亲水性环状序列和羧基端的一个重要功能是构成 G 蛋白偶联域。第一，二内侧环的氨基酸残基在 G 蛋白偶联受体中保守性较高，第三内侧环上的氨基酸残基在不同受体中的变化较大，说明受体与各种 G 蛋白相互作用的特异 性第三环起着关键性作用，而第一，二环无决定性作用。在 2 G 蛋白偶联中绝对必需的第 221氨基酸残基在溶液中能形成一种双亲中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 5 螺旋结构，双亲螺旋结构在受体与 G 蛋白的偶联过程中具有重要作用， 激动剂 结合，导致受体构象变化，从而使螺旋结构适应 G 蛋白偶联反应（吕志良等， 1992）。 分型和分布 20 世纪 40 年代晚期科学家系统地研究了肾上腺素，去甲肾上腺素和几种化合物激活或阻碍 酸化，对受体和 了进一步了解。 （ 1967）根据对肾上腺素和异 丙肾上腺素结合力的大小、将组织中的 为 1 和 2 两种亚型。 （ 1984）在大鼠脂肪组织中发现一种“非典型”的激动剂位点，与常规的激动剂结合力低，而与 激动剂的亲和力较高，这种 称为 3 1要分布于心脏和脂肪细胞膜上，与心脏刺激和脂肪分解有关； 2要分布于骨骼肌、平滑肌、胰岛的 ， 1987），与气管扩张及血管抑制有关。 （ 1989）认为，大部分器官组织中 1 2有可能存在。只是受体种类和数量存 在差异。心脏组织不仅含有 1时存在 2骼肌细胞膜上也存在少量有功能的 1 3研究始于 70 年代中期。陆续克隆出了人（ 989），大鼠 (991)和小鼠 (991)的 3因。通过 交分析技术对 3转录本（ 行研究发现，人、大鼠、小鼠和猪的白色脂肪组织中以及大鼠、小鼠的棕色脂肪组织中分布了大量的 3外，大鼠的肝脏、骨骼肌和回肠以及人的消化系统，心血管系统和骨骼肌中存在 3（ 1999）研究 3猪体组织中的分布时发现， 3猪皮下脂肪组织中含量最多，心脏和骨骼肌中的含量高于肺中的含量，而肝脏中未检测到 3转录本。研究还发现，大鼠脂肪组织中的 3多，而猪脂肪组织中的优势亚型为 1 G 蛋白偶联受体表达的研究进展 G 蛋白偶联受体属于一类整合膜蛋白超家族，由于它对外界刺激细胞反应调节作用中的重要性，使它在药理学上有着重要地位 (. 996)。为了研究 结构和性质， 20世纪 70代，科学家从动物的细胞膜上分离纯化 et 1979； et 1981；et 1984），这种方法制备的 非常少，不足以满足研究受体蛋白所需要的量。科学家发现，这种天然制备的膜蛋白是多种受体蛋白亚类的复合物，多种受体有着相似的药理学性质，多种受体的共存使得研究组织中一种特定的受体十分困难。随着 G 蛋白偶联受体基因克隆技术的发展，异源表达一种特定的受体蛋白，成为研究单一受体蛋白亚类的有效手段（ ,1998； ,1996）。 1986 年 在 志上发表了第一个 G 蛋白偶联受体：金色中仓鼠的 2 基因后，随后人的 2et 987），挪威鼠的 2et 1987)，家鼠的2et 1989)，牛的 2et 2003）基因等许多 G 蛋白偶联受体的基因被克隆出来。异源表达受体主要用于三个方面的研究： 1) 受体与配体结合性质的研究； 2）受体与 G 蛋白偶联的研究； 3）受体结构的 研究。 G 蛋白偶联受体在大肠杆菌，酵母，杆状病毒和哺乳动物等几乎所有的表达系统中都可以表中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 6 达出有功能活性的蛋白，但成功的程度因受体的种类不同和宿主细胞特点的不同而有差异(. 996)。真核动物的 G 蛋白偶联受体在哺乳动物细胞和杆状病毒中表达有其优势，但由于操作复杂，所以更多的科学家选择在大肠杆菌和酵母中表达 G 蛋白偶联受体。即使在同一种表达体系中，不同的 G 蛋白偶联受体表达的水平差异在 2 个数量级以上。不同类的 G 蛋白偶联受体或同一类不同亚类的 G 蛋白偶联受体的 7 个跨膜域的氨基酸是 很保守的，主要差异在于 N 端， C 端和膜外膜内环部分。所以可以得出这样的结论：对表达水平的影响主要就是这些保守性不强的部分。下面介绍 G 蛋白偶联受体在大肠杆菌和酵母中的表达。 G 蛋白偶联受体在大肠杆菌中的表达 通常 G 蛋白偶联受体在大肠杆菌中的表达量非常低，因为大肠杆菌自身不具有 G 蛋白偶联受体，蛋白偶联受体在大肠杆菌中表达，对大肠杆菌来讲是一种毒性蛋白。许多科学家通过尝试，采取了一些策略和方法，改善了 G 蛋白偶联受体在大肠杆菌中的表达量。采取的策略有：融合表达，截去受体基因的非跨膜域，在受体基因的外侧环 中导入正电荷， C 端融合 6多达十几种标签，诱导条件的优化等多种方法，使受体蛋白在大肠杆菌中高效表达。下面就从这几个方面作详细的介绍。 外源基因在大肠杆菌中表达常用的策略是构建融合基因。融合蛋白比天然蛋白更加稳定，还可以提供蛋白纯化的方法。 在 1995 年对膜蛋白的表达有详细的综述。目前用于受体表达构建的融合表达载体有：麦芽糖结合蛋白（ 统，谷胱甘肽 统。一种大肠杆菌中具有的膜蛋白（ 1993），受体蛋白融 合在 面，使表达出的融合蛋白能正确插入到大肠杆菌的膜组织中，提取膜组织和溶解膜蛋白后可以得到表达的受体蛋白。 一种胞内表达的蛋白， G 蛋白偶联受体与 合后，表达的融合受体蛋白在细胞膜内侧松散的聚集在膜上，用柔和的条件可以分离受体蛋白（见表 1 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 7 表 1G 蛋白偶联受体在大肠杆菌中的表达 蛋白名称 N 端融合伴侣 C 端融合伴侣 启动子 蛋白细胞中定位 参考文献 6 细胞膜上 993 神经紧张素受体 io 996 细胞膜上 994 神经紧张素受体 2a 10 细胞膜上 H 2002 苷受体 5 6 细胞膜上 999 五羟色胺受体 . 1 细胞膜上 989 1 肾上腺素受体 6 胞内 1996 嗅觉受体 1B 6 胞内 2000 1 of 在 1987 年法国人 将 1 和 2一种膜蛋白 合后，在大肠杆菌中表达，并将表达的融合蛋白与同位素标记的激素做了结合试验，得出结论融合表达的蛋白与配体有结合活性，他提出表达的融合蛋白可以作为一种有效的筛选配体的工具。英国剑桥大学 在 1993 年将 鼠神经紧张素受体 （ 合在麦芽糖结合酶（ 后面，在大肠杆菌中得到表达。 1996 年 在进一步的研究中，截短了鼠 神经紧张素受体，在 N 端融合麦芽糖结合 蛋白 C 端融合了 18 种 不同的标签。他们的研究结论是 ： 1）受体蛋白 N 端蛋白酶敏感区的去除可以防止融合蛋白被蛋白酶水解；2） C 端标签的加入对表达量有影响，同一受体不同标签造成的表达量差异在 2 个数量级以上。他们认为在大肠杆菌中高效表达受体蛋白的关键因素很多，不仅仅是一方面的因素。主要因素有：1）受体蛋白的热力学稳定性； 2） C 端序列的特点； 3） N 端氨基酸对表达来说是不稳定因素， 4） C 端标签的影响是复杂的。在此之后德国人 002年在英国剑桥 验室用同样的表达系统完成了在大肠杆菌 2 腺苷受体。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 引言 8 将受体蛋白与谷胱甘肽 合后，在大肠杆菌中表达的策略也有应用。 1996 年）在大肠杆菌 表达了 N 端融合 C 端结合 6签的的嗅觉受体。表达的融合蛋白，由于受体蛋白的疏水性使其聚集在大肠杆菌的细胞膜的内壁上，而并未整合到细胞膜上。将表达的蛋白与膜组织重组后，能表现出与配体的结合特性。 2000 年）进一步在大肠杆菌 表达了 11 种 G 蛋白偶联受体 和其中 2 种 G 蛋白偶联受体突变体（见表 1 表 1 融合 13 种 G 蛋白偶联受体 3 ST 体 名 称 全长 构建中残基 1B 仓鼠的 1B 肾上腺素受体野生型 515 32 1B 108R/ 515 32鼠 1B 肾上腺素受体 110R 突变体 A0 鲨鱼 嘌呤核苷受体 352 15 人的黑色素 体 317 179R/鼠的神经紧张素 80R 突变体 424 43鼠的神经紧张素 生型 424 43-1( 人的神经肽 体 384 22-2( 人的神经肽 体 381 39 人的后叶催产素受体 389 29R5(52鼠的嗅觉受体 变体 314 18R5(鼠的嗅觉受体野生型 314 18视紫红质 348 1鱼视紫红质 455 1 1受体及其突变体，构建在 C 端，并在受体基因的 C 端连上 6签。在 13种被表达的 G 蛋白偶联受体中， 1B 肾上腺素受体及其突变体的 515 个氨基酸只将 32基酸构建在载体中，去掉了 N 端和 C 端的部分序列；鲨鱼 嘌呤核苷受体 等 7 种受体和一个突变体，去掉了 N 端部分序列；只有视紫红质（ 3 种受体是将全长构建到表达载体中去的。 现在同一标签（ 6同的受体在同样的表达条件下，表达量差异在两个数量级，表达量从 10%全细胞蛋白。表达水平与蛋白表达过程中表现出的毒性是相一致的。用多线性衰退分析方法研究了受体环区域的正电荷氨基酸数量与表达水平的关系。发现在环区域正电荷数量多的受体，表达量相应就高，分析结果表明： 44%的表达量可能是由受体蛋白膜外 3 个环和膜内 3 个环的正电荷数量决定的。将两个低表达量的受体 1B 肾上腺素受体（ 1B 嗅觉受体（ R5 过环区域导入正电荷的办法使表达量提高了 5。 融合表达受体蛋白策略是改善 G 蛋白偶联受体在大 肠杆菌中的表达量的总原则。不同受体主要的差异在于非跨膜域，这些区域是影响表达的主要因素。对这些区域的改造是科学家研究的重点之一。 表达嗅觉受体时截掉了 N 端 52 个氨基酸，在表达肾上腺素受体时截掉了 第一章 引言 9 端 31 个氨基酸和 319 以后的氨基酸，这些改变都提高了受体蛋白的表达量。 尝试了在受体基因的外侧环中导入正电荷的办法，同样得到了好的结果。 C 端融合标签的研究近年来也有许多进展，带正电荷的标签，带负电荷的标签和中型电荷的标签都有所研究。 对融合受体蛋白的诱导条件的选择和优化，也有许多报道。 er 1998)发表文章谈到，用透性酶缺失（ 大肠杆菌作为表达宿主菌，是解决毒性蛋白表达问题的有效途径。 et 002)报道，在诱导培养基中加入 葡萄糖能有效抑制大肠杆菌本底表达量，因为本底表达量高不利于外源蛋白的表达。在诱导培养基中加入激动剂的拮抗剂，可是提高表达后的受体蛋白与激动剂的结合能力。 受体蛋白是一种亲脂性的蛋白，疏水的氨基酸非常多，在检测表达产物的过程中，科学家发现在细菌裂解液的上清中没 有受体蛋白，将不溶的部分用相应的试剂处理后，检测到表达的受体蛋白（ 996）。受体蛋白与 膜蛋白融合表达时，在 作用下，受体蛋白能插入到大肠杆菌的细胞膜上，在溶解受体蛋白时多种去污剂被尝试过： 1,2，8 等。其中 污剂的效果要好于其他，特别是将这三种去污剂混合后使用，效果会更好。在受体蛋白与 合表达时，超速离心得到的大肠杆菌细胞膜和受体蛋白的复合物处理起来就没有那么复杂，用 2% 液处理超速离心后的沉淀物，就可以把受体蛋白溶解下来。这说明与 合的受体蛋白可能没有正确的插入到细胞膜上，而是