【毕业学位论文】（Word原稿）不同聚合度聚组氨酸的合成及其表征-药学

题目 不同聚合度聚组氨酸的合成及其表征 作者姓名 高 霞 指导教师 周 四 元 二级学院 医 学 院 专 业 药 学 学 号 9012 年 5 月 15 日 西安培华学院本科毕业论文（设计） I 不同聚合度组氨酸的合成及其表征 摘 要 靶向 制剂亦称靶向给药系统， 是通过载体使药物选择性的浓集于病变部位的给药系统 。 研究证实 , 聚组氨酸是一种阳离子型的酸敏性聚合物，人体的正常组织 为 肿瘤组织 间，肿瘤内的这些酸性环境可以作为靶向信号，为癌症的靶向治疗提供新的途径。 本实验拟采用组氨酸为起始原料，先与氯甲酸苄酯反应，生成化合物 2-(苄氧基羰基 )氨基 )5- 基 )丙酸 )，然后再与 2,4成 2 (苄氧基羰基 )氨基 )1 (2,45丙酸 )，通过液质联用(超导核磁共振仪等确证化合物 结构。 氯化亚砜反应，生成4-(1-(45甲基 )恶唑烷 ，最后通过聚合反应得到不同聚合度的肿瘤靶向聚组氨酸材料。 关键词 ：靶向制剂； 敏；聚组氨酸 西安培华学院本科毕业论文（设计） of of is as to is to pH , s pH is be as to a of In we as it to - (15 ,4 - to 2 - ( (1 - (2,4 - 1 5 of by is a -2 to 4 - (1 - (4 - 15- - At we to a of of pH 计） 录 绪 论 . 1 1. 研究的目的和意义 . 2 究的目的 . 2 究的意义 . 3 2 实验部分 . 4 剂与仪器 . 4 要试剂 . 4 要仪器 . 4 剂 、化合物 预处理和所用 显色剂的配制 . 5 试剂预处理 . 5 化合物 预处理 . 6 所用显色剂的配制 . 6 受保护的组氨酸中间体的合成 . 6 路线设计 . 6 合成实验 . 7 3 结果与讨论 . 12 结果 . 12 讨论 . 12 参考文献 . 13 致 谢 . 14 西安培华学院本科毕业论文（设计） 1 绪 论 据世界卫生组织 （ 统计 ， 65 亿世界人口中，每 年有 1000 万人患上癌症 ， 而死于癌症人数约 500 万 ， 每 6 秒钟有一人死亡。占全球死亡人数的 13%！ 我国每年新增癌症患者 180 万 ， 死亡 140 万 ， 平均每 3 分钟就有 1 人死于癌 症 ， 而且癌症的发病率呈急剧上升 趋 势。据 文汇报 报道，在过去 20 年的时间内，我国癌症发病率上升 69%，死亡率增长了 从我国来看，去年癌症新增病例人数约为 139 万，占 世界癌症 发病总数的 17%，基本接近 1/5， 癌症现已成为仅次于心血管病的第二大杀手。 因此近半个世纪以来攻克肿瘤一直是各国政府与科研、医疗机构的主要任务之一。 化学治疗是目前肿 瘤治疗的重要方法之一，但是存在两大问题：一是药物的毒副作用，接受化疗的癌症病人往往出现白细胞、红细胞及血小板数量的减少、恶心、呕吐及脱发等副作用，甚至危及生命；二是肿瘤 (癌细胞 )的耐药性，尽管大多数癌症病人在化疗初期对药物有所反应，但最终肿瘤的耐药性往往会导致化疗失败、病人死亡。如何利用药物的输送手段提高药物的肿瘤靶向性能，并克服肿瘤细胞的耐药性一直是肿瘤药物输送研究者面临的挑战。 靶向制剂亦称靶向给药系统 (是通过载体使药物选择性的浓 集于病变部位的给药系统，病变部位常被形象的称为靶部位，它可以是靶组织、靶器官，也可以是靶细胞或细胞内的某靶点。靶向制剂不仅要求药物到达病变部位，而且要求具有一定浓度的药物在这些靶部位滞留一定的时间，以便发挥药效，成功的靶向制剂应具备定位、浓集、控释及无毒可生物降解四个要素。与注射剂，片剂等普通制剂比较， 由于靶向制剂可以提高药效、降低毒性，可以提高药品的安全性、有效性、可靠性和病人用药的顺应性，所以日益受到国内外医药界的重视 1,3,5。 目前， 研究者们对多种肿瘤药物靶向输送技术 8进行了广泛的研究。 靶向 制剂的分类：按部位有到达靶组织或靶器官的靶向制剂，到达特定细胞的靶向制剂，到达细胞内特定靶点的靶向制剂；按方法有被动靶向制剂载体（如脂质体，乳剂，微囊或微球，纳米囊和纳米球），主动靶向制剂载体 (如修饰的药物载体，载药物体 )；物理化学靶向制剂 (如磁性微球制剂，热敏感制剂， 感靶向制剂，栓塞性微球制西安培华学院本科毕业论文（设计） 2 剂 )。 研究证实 ,肿瘤组织血供减少导致氧分压降低，乳酸等酸性产物大量蓄积，肿瘤内 对这一特点，以肿瘤 靶标的智能靶向制剂概念应运而生。 聚组氨酸是一种阳离子型的酸敏性聚合物 9,16,17，为卷曲状，可包埋药物，同时具有良好的生物相容性。就氨基酸材料而言，他是人体所必需的氨基酸之一，能自行降解代谢被机体吸收和排泄，具有其他材料不可比拟的优点；其次，具有多个活性基团位点，聚合后任然保留某些活性基团，这些活性基团为材料的功能化设计提供了条件。如生物载药体，其主要目的是保护并运载生物活性物质或细胞进入生物体内发挥一定的功能。最后，组氨酸具有酸敏特性，结合其生物相容性可以为癌症的靶向治疗提供新的途径。 综上所述，我们选用 聚组氨酸为 载体 2,4,6,7，再通过化学键合 使聚乙二醇与聚组氨酸结合，制备聚 组氨酸 以期能 制备灵敏响应肿瘤细胞 的靶向制剂。 1 研究的目的和意义 究的目的 恶性肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病，目前肿瘤的治疗方法有手术治疗、放射治疗和药物治疗 (化学治疗 )，但是在很大程度上仍然以化学治疗为主要。尽管临床上已经有许许多多的抗肿瘤药物，但是目前抗肿瘤药物仍然存在毒副作用大，活性低等缺点。如果可以将抗肿瘤的药物包裹于具有肿瘤靶向性的载体上，直接释放于肿瘤组织中，可以减少药物在正常组织的分布，增加药物在肿瘤组织中的浓度，提高药物活性，达到降低药物 对机体的毒副作用。 人体的正常组织 为 瘤组织的缺氧状态使肿瘤细胞无氧糖酵解产生乳酸，导致肿瘤组织呈弱酸性， 间。聚组氨酸是一种阳离子型的酸敏性聚合物，成卷曲状，可以将有活性的药物包埋其中，担当栽药体，而肿瘤内的这些酸性环境可以作为靶向信号，致使聚组氨酸的结构发生改变，由卷曲状态变成伸展状态，可将聚组氨酸所载的抗肿瘤的药物释放于肿瘤组织中，减少了抗肿瘤药物在正常组织的分布，增加药物在正常组织的分布，从而达到降低毒副作用、提高活性的目的。因此，我们研究不同聚合程西安培华学院本科毕业论文（设计） 3 度的聚组氨酸 及其表征，更进一步的研究靶向制剂的栽药体。 究的意义 首先，聚组氨酸是一种阳离子型的聚合物，具有良好的生物相容性，就氨基酸材料而言，它是人体所必需的，能自行降解代谢被机体吸收和排泄，具有其他材料不可比拟的优点；其次，组氨酸是人体必需氨基酸之一，具有多个活性基团位点，聚合后仍然保留某些活性基团，这些活性基团为材料的功能化设计提供了条件，如生物载药体，其主要目的是保护并运载生物活性物质或细胞进入生物体内发挥一定的功能；最后，组氨酸具有酸敏特性，结合其生物相容性可以为癌症的靶向治疗提供新的途径。因此，研 究不同聚合度的聚组氨酸的合成 13,14,15及其表征具有极为深远的意义。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 4 2 实验部分 剂与仪器 要试剂 无水甲醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 无水乙醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 石油醚 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 乙酸乙酯 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 二氯甲烷 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 1,4分析纯 天津市福晨化学试剂厂 四氢呋喃 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心 三乙胺 分析纯 天津市河东区红岩试 剂厂 丙酮 分析纯 天津市河东区红岩试剂厂 冰乙酸 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 氨水 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 吡啶 分析纯 天津市巴斯夫化工有限公司 无水硫酸钠 分析纯 天津市天力化学有限公司 二苯甲酮 化学纯 天津市博迪化工有限公司 氢氧化钠 分析纯 天津市津北精细化工有限公司 碳酸氢钠 分析纯 天津市津北精细化工有限公司 无水氯化钙 分析纯 天津市河东区红岩试剂厂 茚三酮 分析纯 天津市福晨化学试剂厂 氯化亚砜 分析纯 天津市河东区红岩试剂厂 无水乙醚 分析纯 利安隆博华医药化学有限公司 化学试剂 京东化成工业株式会社 2,4化学试剂 成都格雷西亚化学技术有限公司 氯甲酸苄酯 化学试剂 盐城市华大化工有限公司 柱层析硅胶 化学级 青岛海洋化工厂分厂 要仪器 超导核磁共振仪 司 85恒温磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂 低温恒温反应浴 巩义予华仪器有限责任公司 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 红外快速干燥箱 西安市秦州电子科技仪器厂 西安培华学院本科毕业论文（设计） 5 超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司 字显示显微熔点测定仪 北京泰克仪器有限公司 集热式电热磁力搅拌器 巩义市英峪予华仪器厂 真空干燥器 深圳市三利化学仪器设备有限公司 04 电子天平 风干燥箱 上海精密仪器仪表有限公司 三用紫外仪 上海安亭电子仪器厂 制冰机 上海佛格森制冷设备有限公司 液质联用仪 (695 剂 、化合物 预处理和所用显色剂的配制 试剂预处理 四氢呋喃的除水 ： 原理 ：金属钠与水反应的同时也可以和二苯甲酮反应生成二苯甲酮羰基自由基，该自由基显蓝色，遇水或者氧气都会被破坏，所以可以用来指示无水。 步骤：向三口瓶中加入 150四氢呋喃（含水及过氧化物等）再投入适量的金属钠屑回流干燥，在此期间用二苯甲酮检测，无显色时继续加钠屑回流，总共回流 6 小时20 分，三口瓶中溶剂由无色变为黄色，最后变为深蓝色。之后再将干燥好的四氢呋喃用蒸馏法蒸出，保存于加有活化、好过的分子筛的磨口瓶中，尽快使用，不宜存放过久。 注意：二苯甲酮与金属钠反应要间隔一定时间再加入二苯甲酮；此外，蒸出四氢呋喃时，切记勿蒸干，因为瓶内有过氧化物，以防爆炸。最后，实验操作应远离水池并且实验用具保持干燥。 二氯甲烷的干燥： 原理： 8温常压就很容易反应 ，加无水氯化钙回流干燥即可除水。 步骤：向 250有搅拌子的单口瓶中加入二氯甲烷 100上回流装置，回流管上部加干燥管（无水氯化钙），在集热式电磁力搅拌器上加热回流 2 小时，然后再加蒸馏装置，蒸出干燥的二氯甲烷，加活化过的分子筛保存待用。 注意：由于二氯甲烷沸点为 39 ，并且需要搅拌，防止沸腾，搅拌器温度为 30 。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 6 化合物 预处理 化合物 2-（苄氧基羧基） 1-（ 2,4唑 酸的真空干燥 ： 原理： 真空干燥，又名解析干燥，是一种将物料置于负压条件下，并适当通过加热达到负压状态下的沸点或者通过降温使得物料凝固后通过溶点来干燥物料的干燥方式。物料内水分在负压状态下溶点沸点都随着真空度的提高而降低，同时辅以真空泵间隙抽湿降低水汽含量，使得物料内水获得足够的动能脱离物料表面。真空干燥由于处于负压状态下隔绝 空气， 使得部分在干燥过程中容易氧化 的 物料更好的保持原有的特性，也可以通过 注入惰性气体 后抽真空的方式更好的保护物料。 步骤：取适量五氧化二磷放于真空干燥器的下层，将产物 2-(苄氧基羧基 )-(2,4唑 丙酸放于真空干燥器的上层，用凡士林密封磨口处，然后抽真空，关闭活塞，干燥 24 小时后，放置于干燥器中待用。 注意：五氧化二磷吸湿性极强，取出适量后应该用蜡密封，存放于干燥器中。抽真空时要注意压力不可以太大，严格按照真空干燥器的压力范围控制使用，避免爆炸等危险事件。 所用显色剂的配制 茚三酮显色剂的配 制 ： 原理： 弱酸性溶液中共热，反应后经失水脱羧生成氨基茚三酮，再与水合茚三酮反应生成紫红色，最终为蓝色物质。脯氨酸等仲胺氨基酸与茚三酮反应生成黄色物质。该反应可广泛用于各种氨基酸的定性或定量测定。 步骤：精密称量 2g 茚三酮于 50量瓶中，然后，加无水乙醇至刻度线，摇匀即可，放置待用。 受保护的组氨酸中间体的合成 路线设计 本文 首先 以 原料经过 3 步反应得到了 受保护的组氨酸中间体化合物 （ 2-（ 1 （ 2计） 7 （ 1-（ 2,4和化合物 （ 4- （ 1- （ 4 然后由化合物 行下一步的聚合反应。合成路线如图 1、图 2所示。 图 1 受保护的组氨酸单体的合成 图 2 聚组氨酸的聚合反应 合成实验 西安培华学院本科毕业论文（设计） 8 (1) 化合物 0,11,12： 2-（ 1合成及其表征： 合成步骤：向放有搅拌子的单口瓶中加组氨酸 500温下用 6乙酸刚好完全溶解，再加入丙酮 3浴搅拌 5 分钟，使得反应液的温度 降至 0 ，之后缓慢滴加氯甲酸苄酯 浴反应 50 分钟后反应液由澄清变为乳白色的混悬物， 1 小时后采用薄层色谱（ 验，用茚三酮显色，原料反应完毕，停止反应。 后处理：将反应液中的溶剂减压旋转蒸干，残余物为白色固体，将固体用蒸馏水溶解，最后用乙醚萃取 3 次， 测水相与有机相，产物存在于水相中，水相减压旋转蒸干。 结果：得到油状物 合物 二氯甲烷 5其溶解，称取 1g 100的硅胶拌样，用柱层析法分离化合物 混合物，流动相为二氯甲烷 :甲醇 =5:1 过柱分离。最终得到 纯的化合物 420白色粉末，易吸潮，产率为 质谱图如图 3 所示， m/z=288 ，表明所得化合物为目标化合物 D ep ar t o f Ph ar ti i h M U , o o l o f Ph ar 00 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000%0100 1 1 2 8 9 2 2 7 (1 1 ) (2 0 3 :2 4 2 ) Sc a n e 62 8 8 1 7 9 6 1 8 8 1 1 2 1 1 3 1 8 1 1 8 2 2 5 5 2 8 9 5 7 7 2 8 9 5 7 6 2 9 0 3 2 3 3 2 5 3 6 6 3 9 4 5 7 6 5 7 8 5 7 9 5 8 0 8 6 6 7 1 4 6 1 3 8 0 6 7 3 4 8 8 1 9 2 4 图 3 化合物 质谱图 (2) 化合物 3-（ 1-（ （ 合成及其表征。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 9 合成步骤：向放有搅拌子的单口瓶中加 00温下用 1 的碳酸氢钠 3好 完全溶解，检测 7，冰浴搅拌 3 分钟，之后缓慢加入含 329甲酸苄酯的 1,4滴加的过程中反应液由无色透明变为乳白色混悬物，冰浴反应 100 验，并用茚三酮显色，原料反应完毕，停止反应。 后处理：将全部反应液用乙酸乙酯萃取 3 次， 测水相与有机相，产物存在于有机相中，取乙酸乙酯相合并，再用无水硫酸钠干燥 12 h 以上，过滤除去无水硫酸钠，有机相减压蒸干。 结果：得到微黄色油状物 54率为 质谱图如图 4 所示，m/z=422，表明所得化合物为 D ep ar t o f Ph ar ti i h M U , o o l o f Ph ar 00 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000%0100 1 1 2 6 0 7 (1 5 ) (1 7 8 :2 1 3 ) Sc a n e 64 2 2 5 8 8 8 6 1 1 1 2 4 2 1 1 1 8 3 1 4 2 5 5 1 5 6 2 0 7 3 1 7 4 1 8 4 2 3 4 2 4 4 2 5 7 1 4 4 2 6 7 1 2 5 5 6 4 8 7 5 0 4 5 7 0 6 7 8 7 1 7 8 4 7 7 8 1 8 6 7 9 3 9 9 5 6 图 4 化合物 质谱图 (3) 化合物 2-（ 1-（ 2,41 的 合 成 及 其 表 征 ： 西安培华学院本科毕业论文（设计） 10 合成步骤：向放有搅拌子的单口瓶中加入化合物 500mg,用 3蒸馏水溶解，再加入碳酸氢钠（ 600 液（ ） ,冰浴搅拌5 分钟，然后缓 慢滴加 2,4321 1,4应液有无色透明变为黄色混悬物。冰浴反应 6 h， 测，原料反应完毕，停止反应。 后处理：向反应液中加 3 的盐酸，慢慢滴加直至无气泡放出，停止滴加。再向反应液中加适量的蒸馏水，用乙酸乙酯萃取 3 次， 测水相与有机相，产物存在于有机相，取有机相合并，用无水硫酸钠干燥过夜，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸干。 结果：得到黄色的油状物 合物 840乙酸乙酯 5其溶解，称取 1g 硅胶拌样，用柱层析法分离化合物 混合物，流动相为二氯甲烷：甲醇：三乙胺 =20：1： 1 过柱分离。最终得到纯的化合物 420率为 质谱图如图 5 所示，m/z=454。 H 谱如图 6 所示。结果表明所得化合物为 D ep ar t o f Ph ar ti i h M U , o o l o f Ph ar 00 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000%0100 1 1 2 5 - 1 7 0 6 (8 9 ) (1 6 7 9 :1 7 3 0 ) Sc a n e 74 5 4 4 4 1 1 1 2 6 1 3 9 3 3 6 5 1 8 2 1 7 3 3 1 1 2 5 5 4 5 5 9 0 9 4 5 5 9 0 9 4 5 6 4 9 0 7 8 4 4 9 2 5 5 0 7 1 3 5 6 8 8 1 2 8 9 6 9 1 0 9 1 1 9 1 3 9 8 5 图 5 化合物 质谱图 西安培华学院本科毕业论文（设计） 11 图 6 化合物 核磁共振氢谱图 (4) 化合物 4-（ 1-（ 4合成： 步骤：向放有搅拌子的单口瓶内加入 已经干燥好的化合物 00 3干燥的四氢呋喃室温环境将其溶解，此时反应液为黄色液体，再加入氯化亚砜 104应液由黄色澄清变为黄色浑浊，室温下反应，五分钟后反应液变为澄清，继续反应 40 测原料 应完毕，停止反应。 后处理：向反应液中加入过量（ 8 倍量）的无水乙醚沉淀产物，沉淀过滤，取沉淀物在真空干燥箱中干燥，沉淀物可以溶解在硝基甲烷中，将不容的杂质过滤除去，即得产物 西安培华学院本科毕业论文（设计） 12 3 结果与讨论 结果 1. 本文以组氨酸为材料，运用活性基团拼接的方法，先于氯甲 酸苄酯反应，生成化合物 2-（苄氧基羰基）氨基） 15酸）和 3 - （ 1 - （苄氧基羰基） 咪唑 基） （苄氧基羰基）氨基）丙酸），并通过质谱检测，确定了化合物 结构。 2. 本文再以化合物 2,4到化合物 2 （苄氧基羰基）氨基） 1 （ 2,45酸），并通过质谱和核磁共振氢谱检测，确定了化合物 结构。 3. 本文再以 氯化亚砜 反应生成目标化合物 4-（ 1-（ 45基）恶唑烷 讨论 1. 本文用组氨酸和氯甲酸苄酯在不同条件下反应得到了两种化合物 合物 本文实验设计路线的目标中间体，所以在后面的实验中采用 2,4 2. 由于时间等因素影响，本实验只对化合物 结构进行了鉴定，所得化合物 结构还没有最终确定。下一步工作还要对受保护的组氨酸单体进行不同聚合度的聚合反应。 西安培华学院本科毕业论文（设计） 13 参考文献 1 许 金霞 应的聚合物胶束用于肿瘤药物靶向输送的研究进展 , 2009,44(12):1328 2 2003,90(12):3633 2004) 68836885. 4 S . of J. 230(2001) 1124. 5 M of of J. 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