整理生物化学与分子生物学实验

生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验 1 1 分光光度计分光光度计 1 1 基本原理基本原理 溶液溶质在其一定波长的吸收光中 其吸光度值与液层 厚度和溶液浓度的乘积成正比 即遵循朗伯 比尔定律 通过也在 一定液体厚度时测定其吸光度来与标准曲线比较从而测得待测液溶 质浓度 2 2 吸光度与液层厚度和溶液浓度的乘积成正比 称为朗伯 比尔定律 简称比尔定律 即光的吸收定律 其数学表达式为 A lgT bc A 吸光度 又称光密度 O D 吸光系数 L mol 1 cm 1 比例常数 称吸光系数 b 样品光程 cm 通常使用 1 0cm 的吸收池 则 b 1cm c 样品浓度 mol L 吸光度 A 具有加和性 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光 度的算术和 这是多元混合物分光光度法定量分析的基础 若溶液中各溶质的吸光系数 相同 则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例 例 尿嘧啶核苷酸溶液用 1cm 石英吸收池测定 260nm 的吸光度为 0 650 用同一吸收 池测定纯溶剂的吸光度为 0 070 已知其摩尔吸光系数 8 2 103 M 1cm 计算其摩尔浓度 A bC A 溶剂加样品的吸光度 溶剂的吸光度 溶剂加样品的吸光度 溶剂的吸光度 A 0 650 0 070 0 580 b 1cm C 7 1 10 5 mol L 2 等电点的计算方法 等电点的计算方法 标准曲线的制作标准曲线的制作 1 配置一系列浓度不同的标准溶液 2 在测定条件相同的情况下 分别测定其吸光度 3 以标准溶液浓度为横坐标 不必考虑显色剂等引起的浓度变化 以相应的吸光度为 纵坐标 绘制 A C 关系图 4 在相同条件下测出样品溶液的吸光度 从标准曲线上查出浓度 2 酪蛋白的提取过程 酪蛋白的提取过程 1 原理 原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白 它是一些含磷蛋白质的混合物 等电点为 4 8 利用蛋白质在等电点时溶解度最低的性质 将牛乳的 PH 调至 4 8 时 酪蛋白就沉淀出来 用乙醇洗涤沉淀物 除去脂类杂质后便可得到纯化的酪蛋白 2 主要试剂主要试剂 牛乳醋酸钠缓冲液 0 2M PH 6 乙醇 乙醚 氢氧化钠 PPT 后面问题 1 醋酸缓冲液 蒸馏水 乙醇 丙酮洗涤沉淀的目的分别是什么 醋酸缓冲液 调节 PH 到等电点 4 8 蒸馏水 出去沉淀中的可溶物 乙醇 除去沉淀中的脂类物质 丙酮洗涤 脱水 2 最后所得的沉淀中加入 0 1mol L NaOH 的作用是什么 酪蛋白是酸性蛋白质 溶解于碱性溶液中 方便下次双缩脲法测定 3 制备高产率 酪蛋白的关键是什么 刚开始时对牛奶的 ph 的调节 最好是调节到 4 7 越接近越好 这是最主要的 4 请设计另一种提取酪蛋白的方法 1 向酪蛋白溶液中加入高浓度 NH4 2SO4 溶液 2 10000 转 分 5 分钟 去上清液 3 95 乙醇 4ml 洗涤离心 10000 转 分 5 分钟 去上清液 4 丙酮 4ml 洗涤离心 10000 转 分 5 分钟 去上清液 5 0 1mol LNaOH2ml 加水至 10ml 3 双缩脲法测蛋白质含量 双缩脲法测蛋白质含量 1 蛋白质测定的蛋白质测定的 5 种方法种方法 凯式定氮法 Kjedahl 法 紫外吸收法 双缩脲法 Biuret 法 Folin 酚试剂法 Lorry 法 考马斯亮蓝法 Bradford 法 TCA 三氯乙酸 4 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 原理原理 考马斯亮蓝 G 250 染料 在酸性溶液中与蛋白质结合 染料主要是与蛋白质中碱性 氨基酸和芳香氨基酸残基结合 使染料最大吸收峰位置 由 465nm 变为 595nm 溶液的颜 色也由棕黑色变为蓝色 在 595nm 下测定的吸光度 A595 与蛋白质浓度成正比 1 干扰物质有哪些干扰物质有哪些 TritonX 100 SDS 强碱性缓冲液等 2 G250 与与 R250 的区别的区别 比考马斯亮蓝 R250 多二个甲基 染色灵敏度不如 R250 但比氨基 黑高 3 倍 优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体 能选择地染色蛋白而几乎无本底色 所 以常用于需要重复性好和稳定的染色 适于作定量分析 3 PPT 后的后的 4 个思考题 个思考题 说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量 哪几种只能测定其相对说明各种蛋白质含量测定法中哪几种可以测出蛋白质的绝对含量 哪几种只能测定其相对 含量 为什么 含量 为什么 只有凯氏定氮法可以测定蛋白质的绝对含量 因为每 6 25 蛋白质含 1g 氮 试验中可 以除去非蛋白氮 所以 通过氮含量的测定 可以得到蛋白质的绝对含量 其他的几种方 法 由于都使用了标准蛋白制作标准曲线 所以 所测得的未知蛋白的含量 都是相对于 标准蛋白含量而言的 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量使用的局限性有哪些 1 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 因此 Bradford 法用于不同蛋 白质时有较大的偏差 最好选用与待测样品氨基酸成份相同的标准蛋白 2 仍有一些物质干扰此法的测定 主要的 TritonX 100 SDS 强碱性缓冲液等 3 标准曲线也有轻微的非线形 因而不能用比尔定律进行计算而只能用标准曲线来测定 未知蛋白质的浓度 在实验中 使用的水一定是蒸馏水吗 为什么 在实验中 使用的水一定是蒸馏水吗 为什么 因为 Bradford 检测中要用的试剂配制 标准曲线的制作都要用到水 如果不是使用蒸馏 水 可能水里面会有一些游离的离子或者电解质 会影响试剂配制的准确性 干扰实验结果 而 水中残留的有机物等可能会和考马斯亮蓝发生变色反应 这样制作的标准曲线会比实际值偏 高 导致最终浓度检测的结果比实际结果偏低 SDS 干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么 干扰考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理是什么 当溶液中存在一定量的 SDS 后所测得的吸光度比正常值相对减小 但是随着 SDS 浓度 的增加 吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律 由于 SDS 的存在 阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合 使得吸光度减小 由于 SDS 与染料分子对蛋白质的竞争结合 使得显色减弱 吸光度值降低 因此在曲 线前段呈下降趋势 但由于 SDS 破坏氢键 使得蛋白质的空间结构更加伸展 一些原来包裹在结构中的碱 性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来 所以会有少量的吸光度回升 但最终 SDS 与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的 饱和 时 过量的 SDS 就不起作用了 曲线是最后为平缓段 要去除 SDS 的干扰 可以利用它与 K 结合生成沉淀的性质将其去除 K 对考马斯亮蓝 方法不产生干扰 5 醋酸纤维薄膜电泳 醋酸纤维薄膜电泳 原理原理 生物分子在某个特定的 pH 值下可以带正电或负电 在电场的作用下 这些带电分 子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向不同分子以不同速度移动 电泳影响因素电泳影响因素 蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质 数量 自 身大小和形状 此外还受外界因素的影响如 电场强度 溶液的 PH 离子强度等 1 结合实验报告册 回忆操作过程 首先醋酸纤维薄膜先看粗糙面 在粗糙面上画点 样线 画好后做标记 泡在缓冲溶液中浸泡完全 上面无白斑 然后点样 点样后放掉电 泳槽中电泳 电泳后染色 然后脱色 熟悉整个过程 如果把过程打乱 能否正确排序 选择题选择题 结果是 5 条带 哪条带最接近点样线 哪条线最远 要求会画图 画图要记得画点样 线 2 血清蛋白的临床意义 血清蛋白的临床意义 组成 白蛋白 1 2 和 球蛋白 功能 维持血浆胶体渗透压 调节血浆 pH 值 维持酸碱平衡 运输营养物质 代谢物 激素 药物及金属离子等 免疫作用 血清蛋白是血浆中最主要的固体成分 含量为 60 80g L 减少 长期慢性发热 大面积烧伤 白细胞增多 恶性肿瘤 肝癌 淋巴细胞和核 细胞增多 肝功能严重受损 肝坏死 肝硬化 谷丙转氨酶增多 甲状腺功 能亢进 浆膜渗出性损害 结核病 慢性腹泻 慢性肝炎 肾病综合征 吸 收不良综合征 营养不良 贫血 红细胞 红蛋白稍偏低 等 增加 大量出汗 多发性骨髓瘤 腹泻 巨球蛋白血症 严重呕吐 中毒等 6 血糖测定 吴宪血糖测定法 血糖测定 吴宪血糖测定法 1 吴宪血糖测定法的优势吴宪血糖测定法的优势 波长 620nm 优点 灵敏度高 比双缩尿法灵敏得多 工作原理工作原理 葡萄糖葡萄糖 Cu OH 2 Cu2O Cu2O 磷钼酸磷钼酸 钼蓝钼蓝 钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比 所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定钼蓝的蓝色深浅与葡萄糖的含量成正比 所以可以用比色法来测定钼蓝的光吸收值来测定 血糖的含量 波长血糖的含量 波长 620nm 2 为什么选用无蛋白血滤液 为什么选用无蛋白血滤液 有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应 也呈蓝色 干扰最后的结果 3 水浴 水浴 8min 后 取出为何切记摇动 后 取出为何切记摇动 氧化亚铜易已被氧化 4 空腹血糖的正常范围 空腹血糖的正常范围 一般空腹全血血糖为 3 9 6 1mmol L 70 110 毫克 分升 血浆血糖为 3 9 6 9mmol L 70 125 毫克 分升 空腹全血血糖 6 7mmol L 120 毫克 分升 血浆血糖 7 8mmol L 140 毫克 分升 2 次重 复测定可诊断为糖尿 当空腹全血血糖在 5 6mmol L 100 毫克 分升 以上 血浆血糖在 6 4mmol L 115 毫克 分升 以上 应做糖耐量试验 当空腹全血血糖超过 11 1mmol L 200 毫克 分升 时 表示胰岛素分泌极少或缺乏 因此 空腹血糖显著增高时 不必进行其它检查 即可诊断为糖尿病 5 PPT 后的后的 3 个思考题个思考题 Folin 吴宪法为什么要用无蛋白血滤液 吴宪法为什么要用无蛋白血滤液 有蛋白的话会与碱性铜试剂发生双缩脲反应 也呈蓝色 干扰最后的结果 Folin 吴法测定血糖的优缺点是什么吴法测定血糖的优缺点是什么 优点 灵敏度高 比双缩尿法灵敏得多 缺点是费时 要精确控操作时间 标准曲线 也不是严格的直线形式 且专一性比较差 干扰物质比较多 进行比色法测定时 如果测得样品的进行比色法测定时 如果测得样品的 A 值超过值超过 100 该如何处理 为什么 该如何处理 为什么 测得样品值超过 100 是因为有其它还原物质 使其待测液中血糖的浓度过高所造成的 应 该将待测液稀释后再进行比色 7 谷丙氨酸酶的临床意义 谷丙氨酸酶的临床意义 1 谷丙氨酸酶的测定方法 知道什么是赖氏法 什么是改良赖氏法 谷丙氨酸酶的测定方法 知道什么是赖氏法 什么是改良赖氏法 2 改良后的方法优势在哪 改良后的方法优势在哪 1 反应温度 40 改为 37 2 底物浓度 高改低 3 套用卡门氏单位 与速率法一致 反映了酶的真实活性 3 在做实验时用到 在做实验时用到 酮戊二酸 丙酮酸 硝基苯肼 他们的原理以及试剂的作用 酮戊二酸 丙酮酸 硝基苯肼 他们的原理以及试剂的作用 4 该实验的注意事项 该实验的注意事项 2 4 二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙硝醌化合物 溶血标本不宜采用 因血细胞内转氨酶活力较高 影响测定结果 在测定时 如酶活力较大 大于 150KarU 应将样品稀释后再进行测定 5 PPT 后的后的 6 个思考题个思考题 1 1 ALTALT 的临床意义的临床意义 AST 的测定对于肝病的诊断具有十分重要的意义 特别是 AST ALT 比值大小对于临床判定肝病严重程度具有十分重要的意义 是临 床诊治肝病的重要指标之一 2 血清谷丙转氨酶测定的注意事项 以及为何要 血清谷丙转氨酶测定的注意事项 以及为何要 避免溶血 避免溶血 常温下标本不宜久存 2 严重脂血 黄疸 溶血和糖尿病酮症酸中毒病人血 清标本可增加测定的吸光度 测定这类标本应做血清标本对照组 3 当标本的 酶活性超过 150K 时 应将血清中用 0 145mol L 氯化钠稀释重做 其结果乘以 稀释倍数 4 酮戊二酸 2 4 二硝基甲苯肼是直接显色物 NAOH 的浓度与显 色深浅有关 因此它们的浓度必须很准确 5 丙酮酸标准浓度要求十分精确 6 加入 2 4 二硝基苯肼溶液之后应充分混匀 当溶血之后 红细胞中的 ALT 会进入血液中 导致测得的实验数据较大 不符 合实际情况 3 对照管的意义是什么 对照管的意义是什么 减少非试验因素对实验结果的影响 4 底物液为何要 底物液为何要 37 预温预温 5min 人体的体温为 37 只有在此温度下酶的活性才 会达到最大 因此必须先让酶的活性达到最大才与底物反应 5 为什么在制作标准曲线时要加入基质液 为什么在制作标准曲线时要加入基质液 使反应的溶液体积相同 减少因体积不 同而造成的实验非决定性因素的影响 6 为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同 对反应没有影响 为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不同 对反应没有影响 基底液与底物和 酶都不反应 它的作用只是调节溶液的体积 酶活性的单位 国际单位酶活性的单位 国际单位 1961 年酶学委员会建议使用统一单位 在规定条件下 1 分钟分钟 内转化内转化 1 mol 底物所需的酶量底物所需的酶量 称为一个国际单位 IU 又称 U 8 猪肝 基因组 的提取 猪肝 基因组 的提取 实验原理一定要掌握 提取过程中用到的试剂作用 实验原理一定要掌握 提取过程中用到的试剂作用 PPT 后的思考题后的思考题 1 1 实验原理实验原理 DNA 与 RNA 的分离 DNP 在 0 14M NaCl 盐溶液中溶解度很低 而 RNP 则溶于 0 14MNaCl 盐溶液 利用这一性质可将生物组织中的 DNA 与 RNA 分开 DNA 在高浓度的盐溶液中溶 解度最大 去除 DNP 中的蛋白 SDS 使之变性除去 同时破坏核酸分解酶 进一步纯化则利用氯仿 异戊醇震荡除蛋白 震荡时 蛋白质变性 形成凝胶 并与 DNA 分开 DNA 则留在水层中 沉淀 DNA 利用 DNA 不溶于乙醇 因而用乙醇将 DNA 从溶液中沉淀出来 提取过程中用到的试剂作用提取过程中用到的试剂作用 1 取新鲜猪肝 4g 用 0 14mol L NaCl 0 15mol LEDTA 溶液洗去血液 剪碎 加入 10mL 0 14mol L NaCl 0 15mol L EDTA 溶液 置匀浆器中研磨 初步破碎细胞 已做 2 取一支 10 mL EP 管 装入糊状物 基本装满 离心 5 min 10000rpm 弃去上清液 沉淀用 0 14mol l NaCl 0 15mol L EDTA 溶液洗两次 每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心 同上 直到上清液无血细胞 弃上清液 所得沉淀为 DNP DNA 蛋白复合物 粗制品 3 向上述沉淀物加入 0 14mol L NaCl 0 15mol L EDTA 溶液 5mL 然后每管滴加 25 的 SDS 溶液 1mL 边加边振荡 加毕 置 60 水浴 10min 不停振荡 直至溶液变得粘稠并略 透明 取出冷却至室温 此步骤使核酸与蛋白质分离 4 每管加入 5 mol l NaCl 溶液 2mL 蝴蝶形振荡 5min 加入约 1 倍体积的氯仿 异戊醇混 合液 蝴蝶形振荡 5min 离心 10min 4000rpm 此步骤后溶液分三个相 上层水相 DNA 中层变性蛋白质相 下层有机相和残余的 RNA 5 吸出上清液 弃去沉淀 向上清液中缓慢加入 1 5 2 倍体积的 95 乙醇 DNA 沉淀析 出 离心 4000rpm 5min 用玻棒搅出的丝状物则为粗 DNA 6 制备 DNA 溶液 用 0 1mol L 的 NaOH 1mL 溶解 DNA 沉淀 为下次的 DNA 含量测定 提供材料 PPT 后的思考题后的思考题 1 核酸提取中核酸提取中 SDS 氯仿 氯仿 异戊醇各有什么作用 异戊醇各有什么作用 SDS 是阴离子去污剂 作为变性剂和助溶试剂 它能断裂分子内和分子间的氢键 使 分子去折叠 破坏蛋白分子的二 三级结构 而强还原剂如巯基乙醇 二硫苏糖醇能 使半胱氨酸残基间的二硫键断裂 在样品和凝胶中加入还原剂和 SDS 后 分子被解聚 成多肽链 解聚后的氨基酸侧链和 SDS 结合成蛋白 SDS 胶束 所带的负电荷大大超 过了蛋白原有的电荷量 这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异 氯仿可去 除 DNA 溶液中微量酚的污染 异戊醇还可减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡 2 结合本人操作的体会 试述在提取过程中应应该注意些什么 且如何避免大分子结合本人操作的体会 试述在提取过程中应应该注意些什么 且如何避免大分子 DNA 的降解和断裂 的降解和断裂 震荡过程中力度不能过大 力度过大会导致 DNA 分子断裂 也会影响实验的结果 离 心时间应适合 时间太长可能会导致 DNA 分子断裂 时间太短 会导致 DNA 分子不 能得以与蛋白质分离 水浴时间与温度应该适宜 温度为 65 度时间为 6 分钟最适合 3 核酸提取过程中 除去杂蛋白的方法主要有哪几种 核酸提取过程中 除去杂蛋白的方法主要有哪几种 4 种 紫外线吸收法 定磷法 二苯胺法 地衣酚 苔黑酚 法 4 预习 核酸定量测定方法有几种 预习 核酸定量测定方法有几种 9 DNA 样品含量的测定样品含量的测定 有 5 种方法 我们做了紫外法和二苯胺法 其他方法要掌握实 验原理 做实验的两种方法不仅要掌握实验原理 还要掌握操作过程 二苯胺法实验原理二苯胺法实验原理 脱氧核糖核酸中的 2 脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起 加热产生蓝色反应 在 595nm 处有最大光吸收 DNA 在 40 400ug 范围内 光吸收与 DNA 的浓度成正比 在反应液中加入少量乙醛 可以提高反应灵敏度 除 DNA 外 脱氧木糖 阿拉伯糖也有同样反应 其他多数糖类 包括核糖在内 一般无此反应 紫外吸收法实验原理紫外吸收法实验原理 DNA 和 RNA 都有吸收紫外光的性质 它们的吸收高峰在 260nm 波长处 吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的 所以嘌呤 和嘧啶以及一切含有它们的物质 不论是核苷 核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性 10 质粒 质粒 DNA 提取 提取 掌握实验原理 试剂的作用 什么叫做质粒 质粒的结构 质粒有什 么特点 我们用碱裂解法 该法中用到溶液 1 溶液 2 溶液 3 的主要成分和作用 以及最 后的实验步骤和注意事项 PPT 后的 3 个思考题 二苯胺法实验原理二苯胺法实验原理 脱氧核糖核酸中的 2 脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起 加热产生蓝色反应 在 595nm 处有最大光吸收 DNA 在 40 400ug 范围内 光吸收与 DNA 的浓度成正比 在反应液中加入少量乙醛 可以提高反应灵敏度 除 DNA 外 脱氧木糖 阿拉伯糖也有同样反应 其他多数糖类 包括核糖在内 一般无此反应 质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中具有自主复制能力的 共价闭合环状超螺旋结构的小 型 DNA 分子 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法 这种方法是根据共价闭合环状质粒 DNA 与线性染色体 DNA 在拓扑学上的差异来分离它们 质粒的结构特点 质粒的结构特点 1 染色体外的小型 DNA 分子 2 共价闭合环状超螺旋结构 3 自主复 制 作用作用 1 外源 DNA 的载体 2 保存基因 3 表达蛋白 用碱裂解法 该法中用到溶液 1 溶液 2 溶液 3 的主要成分和作用 溶液溶液 由葡萄糖 EDTA Tris HCl 组成 保护 缓冲 50 mmol L 葡萄糖的作用是增加溶液的粘度 悬浮细胞 25 mmol L EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子 防止 DNA 酶对质粒 分子的降解作用 保护作用 10 mmol L Tris HCl 使溶菌液维持溶菌作用的最适 PH 范围 缓冲作用 溶液溶液 II 由 SDS 十二烷基硫酸钠 与 NaOH 组成 裂解 变性 0 2 mol L SDS 1 NaOH PH 12 破坏细胞膜 裂解细胞 注意 碱裂解的时间不要太长 以免基因组 DNA 断裂成小片 段 溶液溶液 III 3mol L HAc pH4 8 和 3mol L KAc 组成的高盐 溶液溶液 复性 分离复性 分离 HAc 溶液能中和溶液溶液能中和溶液 的碱性 使染色体的碱性 使染色体 DNA 变性而发生缠绕 并使质变性而发生缠绕 并使质 粒粒 DNA 复性 复性 KAc 会与会与 SDS 形成溶解度很低的盐形成溶解度很低的盐 POD 十二烷基磺酸钾十二烷基磺酸钾 并与蛋白质 并与蛋白质 形成沉淀而除去 溶液中的形成沉淀而除去 溶液中的 DNA 也会与蛋白质也会与蛋白质 SDS 复合物缠绕成大分子而与小分复合物缠绕成大分子而与小分 子质粒子质粒 DNA 分离 分离 PPT 后的 3 个思考题 质粒提取除了碱裂解法 还有其他什么方法 各种方法的优质粒提取除了碱裂解法 还有其他什么方法 各种方法的优 缺点 缺点 核酸提取过程中 除去杂蛋白的方法主要有哪几种 如果质粒核酸提取过程中 除去杂蛋白的方法主要有哪几种 如果质粒 DNA 中有蛋白质残中有蛋白质残 留 如何判断 留 如何判断 在提取过程中应如何避免大分子在提取过程中应如何避免大分子 DNA 的降解和断裂 的降解和断裂 11 PCR 技术 技术 知道操作中加了哪些试剂 试剂的作用是什么 PCR 的原理主要是 3 个步 骤 变性 退火 延伸 过程是什么样的 PCR 的特性 1 过程 过程 首先 95 预变性设置 1min 1min 后 94 30s 进入变性过程 然后是退火 52 30min 然后引物的延伸 72 30s 从这开始循环 72 10min 最后 0 保温 2 试剂的作用是什么 试剂的作用是什么 一 一 DNA 聚合酶聚合酶 Taq DNA 聚合酶的用量为 1 2 5U 100ul 酶的浓度偏高 非特异性的产物将会 增加 若酶的浓度偏低 侧合成产物偏少 Taq DNA 聚合酶可分为两大类 1 具有校正功能的 有 3 5 核酸酶活性 比如 Vent pfu pwo 等 2 不具有校正功能的 无 3 5 核酸酶活性 比如 一般的 Taq DNA 聚合酶 二 模板 二 模板 核酸模板的量与纯化程度 是 PCR 成败与否的关键环节之一 传统的 DNA 纯 化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本 一般临床检测标本 可采用快速简便的方法溶解细胞 裂解病原体 消化除去 染色体的蛋白质使靶基因游离 直接用于 PCR 扩增 RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法 要防止 RNase 降解 RNA 三 引物 三 引物 引物是待扩增核酸片段两端的已知序列 它决定了 PCR 扩增产物的大小 引物的选择是整个 PCR 反应的关键 引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性及 成功与否 引物是 PCR 特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引 物与模板 DNA 互补的程度 2 PCR 的原理主要是的原理主要是 3 个步骤个步骤 变性 退火 延伸 过程是什么样的 过程过程 首先 95 预变性设置 1min 1min 后 94 30s 进入变性过程 然后是退火 52 30min 然后引物的延伸 72 30s 从这开始循环 72 10min 最后 0 保温 1 模板 模板 DNA 的变性的变性 模板 DNA 经加热至 93 左右一定时间后 使模板 DNA 双链或 经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离 使之成为单链 以便它与引物结合 为下轮反应作准备 2 模板 模板 DNA 与引物的退火与引物的退火 模板 DNA 经加热变性成单链后 温度降至 55 左右 引 物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合 3 引物的延伸 引物的延伸 DNA 模板 引物结合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下 以 dNTP 为反应 原料 靶序列为模板 按碱基配对与半保留复制原理 合成一条新的与模板 DNA 链互补 的半保留复制链 3 PCR 的特性的特性 1 特异性强 特异性强 PCR 反应的特异性决定因素为引物与模板 DNA 特异正确的结合 碱基 配对原则 Taq DNA 聚合酶合成反应的正确度 靶基因的特异性与保守性 2 灵敏度高 灵敏度高 PCR 产物的生成量是以指数方式增加的 3 简便快速 简便快速 PCR 反应用耐高温的 T