【毕业学位论文】（Word原稿）利用T-DNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能生物化学与分子生物学博士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 利用 入突变和 涉技术研究水稻基因功能 .) NA .) NA 摘 要 水稻 (.)是世界上最重要的粮食作物之一，同时也是单子叶植物和禾谷类作物分子生物学研究的模式植物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成，预测的编码基因超过40,000 个。已测定的水稻全长 隆数目也已经超过 32,000 个。确定这些基因的功能将是今后研究的中心任务。鉴于根癌农杆菌介导的水稻遗传 转化方法近年来日趋成熟，利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一。本研究利用 入突变和 涉技术创制水稻突变体，并根据突变体的表型来研究相应基因的功能和表达模式。 本研究是中国高技术研究发展计划项目“水稻突变体库的创制与功能基因组学研究”和国家自然科学基金项目“水稻受体激酶功能及其与环境信号分子的作用”的一部分，通过与合作者的共同努力，取得了以下主要研究进展： 建立了一套高效快速的根癌农杆菌介导的水稻遗传转化程序，从诱导成熟胚来源的愈伤组织开始，约 90d 后即可得到转 化植株。获得潮霉素抗性愈伤组织的效率超过 90%，由抗性愈伤组织分化再生植株的效率超过 80%， 交检测表明大约 95%的潮霉素抗性植株含有入片段。提高转化效率的关键在于降低共培养温度至 1922 在选择培养 101512d。利用上述程序构建了大规模的水稻增强子捕获突变体库。 评估了 强子捕获系统在水稻中的效率。对 9,120 株独立增强子捕获标签系的 色分析，观察并统计了胚，胚乳和种皮中 因的表达频率，约 40%的标签系在其中至少一个部位呈 性反应。从阳性标签系中随机挑选出 212个样品，进行 根和叶 )的 色分析，约 70%的样品在其中至少一个部位呈 性反应。利用 术从这 212 个样品中分离扩增 入位点的侧翼序列，共得到 127 条水稻基因组侧翼序列，并对 插入位点和整合模式进行了详细的分析。根据插入位点的侧翼序列信息预测基因和启动子，并随机挑选了 10 个预测的启动子进行表达模式分析，有 6 个启动子表现出与原增强子捕获标签系相同的 达模式。上述结果表明强子捕获系统是一种分离水稻基因表达调控元件和研究水稻基因表达模式的有效方法。 利用 入引入 涉系统的方法，对一些预测的水稻类受体激酶基因进行功能分析。通过对 涉植株的筛选，发现了 1 个新的与稻瘟病抗性相关的类受体激酶基因 (利用 交检测从 因 涉植株中筛选出了 单拷贝插入且 因表达量明显降低的株系用于进一步的分析。对该株系的 涉植株和 因的 测，结果表明抑制 因的表达后，水稻对稻瘟菌 (敏感性增加，而过量表达 因可以增强水稻对稻瘟病的抗性，即 因的表达水平和水稻的稻瘟病抗性直接相关。 关键词： 涉， 受体激酶，水稻，增强子捕获 .) is of in a of of is 0,000 2,000 of is As is to of of In NA to on on is By as A . of of be as 0d of 0 0%, 5% 922 12d 015d. in 1 ,120 US on 0% in of at 12 US on 1 0% US CR 127 12 of in 0 6 US as of in on a on 1 0 to on V 目录 第一章 文献综述 1 稻基因组学研究概述 1 稻 入突变技术研究进展 2 入与基因敲除 4 活标签技术 5 获标签技术 6 入位点侧翼序列的分离 8 涉技术研究进展 9 涉的作用机制 10 涉的参与因子 11 涉的功能和意义 11 涉技术的特点和方法 12 涉技术在植物中的应用 13 物类受体激酶基因研究进展 14 研究的意义和技术路线 15 第二章 利用 17 料与方法 17 稻转化所用双元载体 17 稻材料和成熟胚来源的愈伤组织诱导 18 性愈伤组织的转化 18 霉素抗性愈伤组织筛选和植株再生 18 V 生植株的 交检测 19 果 19 稻遗传转化的效率及其影响因素 19 生植株的 交检测 22 论 23 第三章 水稻增强子捕获突变群体的功能分析 24 料与方法 24 统的增强子捕获功能 24 稻组织的 织化学染色 25 入位点侧翼序列的分离 25 翼序列的测定 26 翼序列的同源性查找和启动子预测 26 测启动子的功能 分析 27 果 29 1代种子和幼苗中 因的表达模式 29 翼序列的扩增 31 翼序列的结构分析 32 入位点的分析 33 动子的预测和表达模式分析 33 入与 色表型的共分离分析 38 论 39 第四章 水稻类受体激酶基因的 涉分析 43 料与方法 43 稻用 涉诱导载体和基因过量表达载体的构建 43 受体激酶基因 涉、过量表达和启动子检测载体的构建 45 瘟菌接种 46 交 46 交 47 测 48 果 49 稻用 涉诱导载体和基因过量表达载体的构建 49 受体激酶基因 涉载体的构建 50 瘟菌筛选 涉突变体及相应 因的结构分析 51 因 涉植株的 测 53 因 涉植株的 抗瘟性检测 53 因过量表达载体的构建 55 因过量表达植株的 抗瘟性检测 56 因表达模式的检测 56 它 因的 涉突变体 58 论 59 结论及创新点 62 参考文献 64 致谢 74 作者简历 75 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 1 第一章 文献综述 水稻 (.)作为世界上最重要的粮食作物之一，是全球超过 50%人口的主要食 物和热量来源。虽然近 30 年以来，新的高产品种的培育和耕作技术的进步使得水稻产量翻番，但是仍然不能满足今后的需求。据估计，今后 20 年里，全球对于水稻的需求量将以每年 1%的速度递增，这就要求水稻平均产量要在现有的约 4 吨 /公顷的基础上大幅度提高。提高产量需要通过以下途径来实现：培育更好的高产品种，同时提高主栽品种对于病虫害和干旱、盐碱、低温等非生物逆境的抵抗能力。因此，从水稻中分离鉴定与产量、品质、抗性和发育等农艺性状密切相关的基因，阐明它们作用的分子机理和表达调控网络并应用于育种实践，是水稻生物技术研究的长期任务。水稻基因组学的研究是上述工作的基础，对水稻基因组序列进行结构和功能分析，具有重要的意义 (et 2004)。 稻基因组学研究概述 水稻成为单子叶植物和禾谷类作物分子生物学和基因组学研究的模式植物 (n, 2001)，得益于以下几个优点：基因组小，仅 390右 (et 2005)；分子生物学和发育生物学研究的基础良好，积累了大量的背景资料 (et 2005)；已经构建了精细的遗传和物理图谱 (et 2002; et 2002)；建立了较为成熟的遗传转化方法 (et 1997; et 2004)；水稻与小麦 (玉米 (大麦 (黑麦 (高粱 (禾本科作物的基因组具有良好的共线性关系，因此水稻基因组结构和功能分析的方法、技术和结果对这些作物的相关研究有重要的借鉴作用 (2002)。水稻和拟南芥 (因组序列测定和分析结果表明，两种模式植物基因组之间的共线性关系十分有限，因此水稻基因组学研究具有不可替代的作用 (2000; et 2002; et 2002; et 2002)。 水稻结构基因组学的研究成果为功能基因组学研究打下了坚实的基础。 1997 年，国际水稻基因组测序计划 (始实施，以粳稻 (种日本晴 (模式材料，绘制高质量的基因组遗传和物理图谱，采用鸟枪法(定 1 隆序列并根据它们在物理图谱上的先后顺序进行拼接，所得到的数据随 时释放到 公共数据库中 (2000)。 2002 年 12 月完成基因组草图的绘制，精确度达到 并预测了超过 60,000 个遗传基因； 2004 年 8 月完成全部 12 个水稻染色体共 序工作量的 370并公布了装配完成的 12 个染色体分子的 列；2004 年 12 月序列测定工作全部完成 (et 2005)。 司的水稻测序工作 (et 2002)同样选择日本晴为模式品种，结果表明水稻 基因组含有 32,00050,000 个基因， 98%的玉米、小麦和大麦的已知蛋白可以在水稻基因组中找到编码其同源物的基因，对各类基因的数量及其在基因组中所占的比例也进行了估算 (图 日本水稻全长 定计划工作组于 2003 年公布了他们的研究进展 (et 2003)：中国农业科学院博士学位论文 文献综述 2 从日本晴中分离并测定了 28,469 个水稻全长 隆的序列；通过在公共数据库中进行同源性查找，推测了其中 21,596(个 编码的蛋白及其功能；通过将 隆作图定位到基因组 ，揭示了水稻基因组中 19,00000 个转录单位的位置；蛋白信息分析结果表明部分 码的蛋白存在于水稻中，而不存在于拟南芥中， 64%的 码产物可以在拟南芥中找到同源物。目前，全长 隆的测定量已达 32,127 个，克隆的平均长度为 图 稻预测基因的分类 (et 2002) of 着序列测定及基因发掘工作的完成，确定这些基因的功能将是今后研究的中心任 务 (An et 2005)。利用转基因的方法获得突变体被认为是水稻功能基因组学研究的主要途径之一，根据所得突变体的表型在分子水平鉴定与表型相关的基因，从而揭示它们的功能 (et 2004)。目前已经获得的各种类型的水稻突变体为基因的功能分析提供了极大的便利，突变表型涉及器官发育，形态发生和各种生理农艺性状，如叶、茎、根等营养器官以及花、花序、种子、胚、胚乳等生殖器官和组织的发育缺陷，生长期的变化和抗病虫害及非生物逆境能力的改变等 (et 2005)。 入突变 ( 涉 (术是目前较为常用的两条创制水稻突变体的技术路线。利用 入突变技术不仅可以获得基因敲除 (变体，还能用于捕获基因表达调控元件和获得激活标签 (变体； 术能够特异性的抑制目标基因的表达，其效率要高于传统的反义 术。本研究利用这两种方法对水稻基因进行功能分析。 稻 入突变技术研究进展 得基因的功能发生改变并产生突变表型， 签”。与转座子和逆转座子标签法相比， 后代中较为稳定的优点。根癌农杆菌 (导的 化效率高，嵌合体少， 入基因以孟德尔方式遗传等优点，是进行大规模转化的首选方法 (2003)。目前 对于 文献综述 3 (et 2004)，酚类化合物作为信号分子激活农杆菌 物转化所用的质粒载体多为双元 (体系统，即遗传操作和携带转移基因所用的小质粒带有去除了 质粒可在大肠杆菌 (农杆菌中繁殖；农杆菌中的 前 et 2003; 2004; An et 2005)，其基本技术路线如图 et 1999)。 图 et 1999) 前已经构 建了多种类型的水稻突变群体，包括普通的插入突变 (et 2004)，激活标签(et 2002)，基因捕获 (et 2000; et 2004)和增强子捕获 (et 2003; Wu et 2003; et 2004; et 2004)等，所得到的 00,000份。并对转基因水稻 植株中 et 2003)， et 2003; An et 2003)以及 报告基因在水稻中的表达模式 (et 2005; et 2005)进行了详细的分析。从水稻 文献综述 4 相应基因的功能分析 (et 2003; et 2003; et 2003, 2004a, 2004b)。 et 1999)：当 可能造成无义突变 (即功能完全缺失；当插入位点在启动子或 3端非翻译区上，有可能造成基因表达量降低；当带有启动子的 能会使基因表达增强； 区也可能只造成基因功能的部分失活；当基因组中存在多个 以发生多点敲除，使多个基因同时失活；另外 选获得具有突变表型的株系后，需要先得到 后通过共分离 (或互补实验 (根据侧翼序列分析找到 对应的野生型拷贝转入突变株后，能够使其表型恢复正常 )来确认突变表型是由 目前植物遗传转化技术的发展已经使得饱和突变 体库的建立成为可能 (et 2003; 2003)。所谓饱和突变体库是指在一个突变体库中基因组的每个基因中都至少含有一个外源片段的插入。所创建的突变体库的饱和程度是影响利用插入突变研究基因功能的效率的重要因素。 1999)认为，决定一个特定基因中 因平均大小、基因组大小和 中只有一个因素，即 入 概率的计算可以由公式 P=1-(1-(L/C)中 n(2001)依据此公式估算，在假定 f=果突变体库的 9%，库的大小应达到 471,000个标签系。 曾经认为 近年来的研究表明这种随机性只是相对的， 录活性高的区域 (et 2000)。 2003)对超过 1000个 有 标签在重复序列区；标签在基因内部和基因间区的分布比例与这两种区域在水稻基因组中的分布比例相吻合； 端和3端外侧各 500及内含子区域。 2003)从 6,749个水稻标签系中分离了 3,793条 建立了侧翼序列数据库，他们的分析表明在编码区起始和终止位置，以及接近 有插入位点的平均 稻全基因组的1,846个被 记”了的基因按功能分类后的分布比例也与水稻基因组中各类基因的分布比例相似，表明 入频率在染色体末端较高，着丝粒处较低。 2004)分离了 7,480条 据此在水稻染色体上定位了 6,645个 果表明 、 2、 3、 6号染色体上的插入频率略高； 50虑到以上因素， 以及有些基因功能的破坏是致死的，不可能得到突变株，使水稻基因组饱和所需 利用农杆菌介导的转化方法构建的水稻突变库， ， 3045%中国农业科学院博士学位论文 文献综述 5 的标签系为单拷贝插入。多拷贝插入的标签系比单拷贝插入的标签系更容易产生基因沉默现象。2003)对插入到水稻基因组中的 果表明 为稳定，超过一半的 左边界 (守性较低，缺失片段长度可达 180 NA(列； 5%，这对 et 2003)。 许多插入突变体没有可见的表型改变，可能原因之一是突变基因有冗余 (同一基因家族的其它成员有功能重复。突变 体观察不到表型的另一可能原因是所破坏的基因可能已经进化到仅在特定的生理状态下才有功能，为检验某一未知功能基因的有条件表型，必须采用一系列环境条件或生理条件的处理加以诱导。而且许多基因在多个发育阶段有功能，这些基因的突变可导致早期致死，或者可能有多效性，它能在一个特定的代谢途径中掩盖某一基因的作用。此外，瞬间表达的基因、表达水平很低的基因、以及在少数细胞中表达的基因，都可能难以被鉴定出来。因此在大多数情况下基因的敲除并不能够产生明显的表型变化，这给分析基因功能带来了难度。对传统 如激活标签和捕获标签 (术，在一定程度上解决了上述问题。 对于一些被插入破坏后并不能导致明显的表型变化基因，可以利用激活标签进行标记，产生功能获得性突变。具体做法就是使 动或增强插入位点附近基因的转录，使它们过量表达或异时空表达。该技术已在拟南芥中得到广泛应用 (2003)。最常用的 花椰菜花叶病毒 ) 35 上游或下游 )，则可以激活正常情况下不表达或表达极弱的基因，导致显性的功能获得性 (变。另一种激活标签的方法是使 得被 前在拟南芥中已有应用热激的或化学诱导的激活标签系统分离鉴定基因的报道 (et 2000; et 2002)。激活标签系 统引起的基因表达增强，其突变表型一般在当代植株中就能观察到；增强子可以远距离作用，且不具备方向性，这些因素均有助于提高激活标签标记基因的效率。目前还不能肯定增强子作用时是否会改变靶基因原有的表达模式(et 2000)。 2000)通过分析拟南芥 定出了 30个不同表型的显性突变体，并证实在其中几个突变体中与外源增强子相邻的基因发生了过量表达。激活标签系统不仅可以用来分离与植物生长发育相关的基因，而且能够用于植物抗病基因的分离鉴定 (et 2004)。 水稻中存在大量的冗余基因序列 (et 2002)，因此激活标签系统的引入对于研究这些基因的功能是十分必要的。 35et 2002)，抽样分析结果表明大约 40%的增强子插入位点附近的基因表达量获得升高。 中国农业科学院博士学位论文 文献综述 6 签”的基因和报告基因 (合来反映该基因的活性或表达模式，可以在没有突变表型和序列信息的 情况下鉴定出目标基因 (2000)。该方法 可分离鉴定杂合子中的致死基因， 功能上冗余的基因和在多个发育阶段发挥功能的基因， 而且报告基因检测的敏感性使瞬间表达的、低丰度的和只在少数细胞中表达的基因也可分离， 这些都是传统的遗传分析方法难以做到的 。 捕获标签系统有 3种基本类型：增强子捕获，启动子捕获(基因捕获，每种类型的系统都能对插入位点的顺式作用元件作出反应 (图 图 强子捕获，启动子捕获及基因捕获载体的结构 (2000) of 强子捕获系统中的报告基因和一个基础启动子融合，基础启动子一般只包含 凭自身不能驱动报告基因的表达；但是当带有增强子捕获系统的 些调控元件就会激活基础启动子，驱动报告基因的表达，同时这些元件和受到它们调控的植物基因就被报告基因“捕获”了。 启动子捕获和基因捕获系统包含无启动子的报告基因 ，只有当报告基因以正确的方向插入到一个转录单位里时，才可能驱动报告基因的表达。启动子捕获系统需要报告基因插入到一个外显子中，形成转录融合，然后被捕获的启动子驱动报告基因的表达。 通过检测报告基因是否表达、中国农业科学院博士学位论文 文献综述 7 以及报告基因在生物体中的表达部位，可以判断报告基因插入位置附近是否有基因的启动子存在以及该基因的表达是否有特异性。进而可以从报告基因的邻近顺序中分离出启动子及其相应的基因。 2000)试验了用无启动子的 过 分离水稻中的启动子。 2004)构建了 提高该系统在水稻中的捕获效率。 基因捕获系统在报告基因之前有一个或多个剪接受体序列，当报告基因插入到一个内含子中时，染色体上被捕获基因的剪接供体位点就会和报告基因的剪接受体位点发生剪接，导致被捕获基因的上游外显子和报告基因的融合。除了转录融合，启动子捕获和基因捕获系统还能产生翻译融合，提供有关蛋白质定位的信息。 3种基因捕获系统各有优缺点。增强子捕获系统没有报告基因必须以正确方向插入基因内的限制，因此在该系统中报告基因的表达频率较高，但 由于增强子能在相当远的距离外激活基因的表达，给分离鉴定目标基因及调控元件带来了一定困难；启动子捕获和基因捕获系统虽然有上述限制，导致报告基因表达频率低，但是一旦报告基因表达，就表明报告基因很可能已经插入基因内部，使得被捕获基因的分离鉴定相对增强子捕获系统要容易一些。 图 酵母的转录激活蛋白个 以特异性的结合到上游激活序列 (激活下游报告基因的表达。因此，报告基因的表达与 来又用单纯疱疹病毒 样改建后的反式转录激活能力得到了进一步加强。研究表明 et 1998; et 2004)。本研究采用改进的水稻转化方法，构建了大规模的带有群体。 该系统还可以用来诱导在 图 其过程如下：首先利用载体 从中筛选获得特异性的增强子捕获系；然后利用载体 获