【毕业学位论文】（Word原稿）大豆C2H2型锌指蛋白转录因子基因的克隆与鉴定生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 学位论文 大豆 锌指蛋白转录因子 基因的克隆与鉴定 2L.) 2L.) I 摘 要 锌指蛋白是一类广泛存在于原核和真核生物体中的重要转录调控因子 ， 在动植物的生长发育过程中均起着重要作用。 锌指 蛋白又称为 锌指或经典锌指，是锌指蛋白家族中最大的一个亚族，也是真核生物转录因子中研究最多的一种与 蛋白质结合的模式 结构。 目前报道的植物 锌指蛋白主要参与植物各个 时期的生长 发育， 以及胁迫应答的调控过程。 本 研究 通过 分析 豆 据库 中 已知 的两 段 保守 序列，发现 它们的 3和 5端拼接后其重叠部分具有 100% 同源性，表明它们是同一个基因序列的两个片段，该序列 与已发现的大量的植物中的 锌指蛋白保守基序 具有很高的同源性 。 根据 该序列 设计特异性引物，进行 得 了 一个 包含两段序列的 放阅读框序列，其 核苷酸 长度分别为 516 名为 码一个具有 172 个氨基酸的蛋白，分子量约 19 有两个由 21个氨基酸组成的 守基序，每个保守基序都具有植物 锌指蛋白 特有的 一个典型的 锌指蛋白 。 同时， 有 结构序列。 定量分析表明： 表达受冷、 诱导。 够 在大肠杆菌中以 合蛋白的形式表达 ， 纯化融合蛋白 行凝胶阻滞实验，结果表明 ：指蛋白在体外能与核心序列 很强的结合活性 ， 反向重复中的一半位点中引入两个碱基突变的突变探针结合活性有所下降 ， 反向重复中的两半位点中都引入两个碱基突变的突变探针几乎没有结合活性 。 说明 指蛋白与核心序列 异性结合。 通过设计特异性引物 增及酶切、连接等方法获得了 : 1 个缺失第一个保守域及与第一个保守域 C 端顺次衔接的 7 个氨基酸的突变体 （命名为 、 1 个缺失第二个保守 域及与第二个保守域 N 端顺次衔接的 19 个氨基酸的突变体 （命名为 和 3个分别缺失 7 个、 19 个和 26 个氨基酸的不同程度地缩短两个保守域之间的距离的 分别顺次命名为 。突变体凝胶阻滞实验结果表明： 核心序列不结合， 氨基酸缺失 最少的 核心序列 结合活性比 几乎不结合 。 说明 指蛋白的第一个保守域及与第一个保守域 C 端顺次衔接的 7 个氨基酸、 白第二个保守域及与 第二个保守域 N 端衔接的19 个氨基酸对其与核心序列 结合都是必需的 ， 而 两个保守域之间的氨基酸序列组成则 是影响 指蛋白与核心序列 结合的重要因素。 通过 将构建的 因的双子叶植物转基因表达载体 空 体，借助于农杆菌侵染法，转入模式植物拟南芥中 发现 ， 同期 转基因型拟南芥的根长明显小于 对照，但是侧根 数目似乎 比转入空 体的拟南芥 的多 ， 说明该基因可能参与根的发育。 氨基酸分析表明 表达 不仅 提高了 基因型拟南芥 中 脯氨酸的含 量，而且在低温 胁迫 条件下， 转基因型拟南芥中以脯氨酸为代表的多种氨基酸以及 含量在 5 小时都有显著增加，且都明显高于对照 , 说明能 对提高植物的抗冷特性有 一定的 作用。 本研究 克隆 的 因 ，是大豆中的一个新的转录因子基因，对其性质和功能进行了初步研究。并通过突变锌指蛋白基因， 初步 明确了锌指蛋白的分子 作用 机制。 关键词 ： 大豆 ， 录因子 ， 锌指 蛋白 ， 缺失突变 ， 胁迫 he of is an of in an in in of 2as a in a of At it is in In on ST of a a 2H2 an 16 bp a 9 KD 72 2H2 a of by as to in or in BA is . to in or of of of We of of or is of of is of of It of a is 2H2 on of ro is of in is in of of H3 in is in As a in is on is 录 第一章 前言 . 1 录因子的研究背景 . 1 物转录因子的结构 . 1 录因子的研究进展 . 3 指蛋白的研究进展 . 4 2指蛋白的起源 . 4 指蛋白的分类及 锌指蛋白的基本结构 . 5 指蛋白调控基因转录的功能 . 6 物 锌指蛋白 . 7 题目的、意义 . 10 术路线 . 11 第二章 锌指蛋白转录因子 因的克隆 . 12 言 . 12 料 . 12 物材料 . 12 种及载体 . 12 及化学试剂 . 12 剂盒 . 12 物 . 12 序 . 12 要仪器 . 12 蛋白质序列分析 . 13 法 . 13 豆基因组 提取 . 13 豆总 提取及纯化 . 13 的质量及浓度测定 . 14 . 15 . 15 物的回收与纯化 . 16 接反应 . 16 受态细胞的制备 . 17 组质粒的转化 . 17 粒 提取 . 17 切反应 . 18 2 物及酶切产物的琼脂糖凝胶电泳检测 . 18 列测定 . 19 果与分析 . 19 的基因 片段的获得 . 19 标片段的 T 载体重组体构建 . 21 组体的筛选和鉴定 . 22 标基因序列、 结构及功能分析 . 23 论 . 27 第三章 表达特性与 其突变体的体外结合特异性及转基因植物分析 . 28 料 . 28 物材料 . 28 株及载体 . 28 及化学试剂 . 28 剂盒 . 29 要仪器 . 29 法 . 29 因的表达特性分析 . 29 白及其突变体的体外结合特异性分析 . 29 化载体的构建和转基因植物分析 . 35 果与分析 . 39 因的表达特性分析 . 39 白及其突变体的体外结合特异性分析 . 40 因转基因植物分析 . 48 论 . 54 第四章 结论 . 56 参考文献 . 57 致谢 . 65 作者简历 . 66 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前言 1 第一章 前言 录因子的研究背景 基因转录 分为 正调控和负 调控。如细菌基因的负调控机制是 ： 当一种阻遏蛋白 （ 结合在受调控的基因上时，基因不表达； 从靶基因上去除阻遏蛋白后， 合酶识别受调控基因的启动子，使基因得以表达，这是正调控。这种阻遏蛋白是反式作用因子。 转录因子 （ F） 也称反式作用因子，是指那些具有同真核生物启动子特定列结合活性的蛋白质分子，或者是具有已知 合域结构特征的蛋白质分子，其主要功能是激活或抑制基因的转录效应。 转录因子是转录起始过程中 合酶所需的辅助 因子。真核生物基因在无转录因子时处于不表达状态， 合酶自身无法启动基因转录，只有当转录因子 （ 蛋白质 ） 结合在其识别的 列上后，基因才开始表达。 转录因子在 生物个体发育的复杂过程中，通过蛋白质与 相互作用，实现了对基因表达的调节。基因表达的调节主要发生在转录水平上，而在转录水平上与 生相互作用的蛋白质分子中，最具多样性的是转录因子。 植物各种诱导型基因的表达主要受特定转录因子在转录水平上的调控。 自从 1987 年 继从高等植物中分离出的调控干 旱、高盐、低温、激素、病原反应及生长发育等相关基因表达的转录因子已达数百种（ et 2001） 。 近年来，发现很多逆境相关的转录因子，如大豆中 编码一个受冷胁迫诱导的 锌 指蛋白转录因子的基因 et 2001） 。 在高等植物中结构了解较清楚的是拟南芥中的 结合蛋白等少数转录因子（ et 1997）。拟南芥基因组测序已经完成，据推断，至少有 1553个编码转录因子的基因 。 约占其估计基因总数的 （ et 2002） 。拟南芥中转录因子数量如此之大，种类之多，表明了高等植物转录调控的复杂性 。 所以，转录因子的研究，对揭示基因表达的发育调节的分子机理具有重要的意义。 如何 利用可以调控多个逆境相关基因的表达 转录因子来改良植物的抗逆性获得 较为理想的效果 、明确 有关高等植物转录因子编码基因的结构和功能已成为植物基因表达调控领域的热门课题。 物转录因子的结构 从蛋白质结构分析， 典型的植物转录因子 一般 具有 合 域、转录调控域 （ 包括激活域或抑制域 ） 、寡聚化位点，以及核定位信号等 4 个功能区域。转录因子通过这些功能区域与启 动子顺式元件作用，或其它转录因子的功能区域相互作用来调控基因的表达。但是，不同的转录因子可能缺少某一结构域，如转录调控域（ et 1992）或 合域 （ 包括激活域或抑制域 ） (et 1997)。 典型的转录因子一般只有一个 合区，但有的转录因子如拟南芥（ 水稻（ 南芥（ 含两个 合区（ et 2001） 。 在 长期演化过程中，尽管同类型转录因子的功能可能不相同，但它们与 合的结构域或与其他蛋白质相互作用的结构域是高度保守的（杨致荣 等 ，2004）。 中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前言 2 合域（ 合域是指转录因子识别 式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子 合域的氨基酸序列较为保守。 合区中氨基酸的排列决定了转录因子结合的专一性。例如在水稻 白的 构域中，第 14 位的缬 氨酸和第 19 位的谷氨酸决定了 白对 件的核心序列 ） 具有同样的结合效率。在 白的 构域中，第 14 位是 缬 氨酸，但第 19 位却不是谷氨酸，而是 缬 氨酸，它与顺式作用元件 结合活性大于与 结合活性 （ et 2003） 。因此，这段氨基酸序列决定了转录因子特异性。转录因子中其 它 氨基酸起到增强其结合的作用，另外， 合域的二级结构也可能影响转录因子结合特异性。在这一过程中一些中性氨基酸残基，例如脯氨酸和甘氨酸更为重要。 典型的高等植物转录因子结合域 有： 构域 (et 1996)、锌指结构域（ 1998）、 构域（ et 1995）、 构域（ et 1997）、 构域（ et 1997）、 构域（ et 1996）以及 et 1997）结构域等。其中的一些结构域又可根据其特征中保守氨基酸残基的数量和位置分为几个亚类，如根据锌指蛋白特征去中 半胱氨酸（ 组氨酸 (残基的数量和位置分为： 3 亚类 录调控域（ 转录调控域是转录因子调节目的基因表达的区域，包括转录激活域和转录抑制域，它们决 定转录因子功能的差异。一般有一个或多个。将去掉的 合区的转录因子与酵母 l 连接，形成融合蛋白，可用来研究转录因子的转录激活功能 (et 1997)。转录因子的主要区 别在于转录调控域各不相同 (et 1998)。转录因子的激活或抑制作用依赖于它对靶基因的转录起激活还是抑制作用。 转录因子对靶基因的抑制作用可能是通过与其他转录因子竞争同一顺式调控元件进行的。 聚化位点（ 寡聚化位点是不同转 录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列具有高度的 保守性 ，大多与 合域相连并形成一定的空间构象，如 转录因子的寡聚化位点包括 1 个拉链结构，而 b/ 转录因子含有螺旋 环 螺旋 结构， 录因子的寡聚化域则形成两个螺旋和两个折叠（ et 2001）。这些寡聚化位点空间构象的变化导致了转录机制的多样性，从而使转录因子具有调控高等植物基因表达的能力。许多高等植物的转录因了形成异聚或同聚物以影响 合的特异性、转录因子对启动子元件的亲和（ et 1992）和核的定位 （ et 1997） 。 定位信号（ 核定位信号是转录因子中富含精氨酸和赖 氨酸残基的核定位区域，转录因子进人细胞核的过程受该区段控制（ et 1994）。不同转录因子的核位信号在序列、结构和数量上存在差中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前言 3 异，主要是根据精氨酸和赖氨酸的排列分类。不同转录因子中 数目有所不同，一个转录因子可含 1 至数个 能区，它们不规则的分布在转录因子中，有的 玉米的 et 1995）转录因子的 存在于其他功能区域内。 在研究 5 5在细胞中定位的分子机制时发现， 核定位信号对 5细胞分布有决定作用。目前，已经在水稻的 et 1995），玉米的 转录因子 et 1995）等多种转录因子中发现了核定位信号区。不同植物转录因子核定位信号的序列、组织器官的分布和数量存在着差异。另外，不同转录因子的核定位信号的数目也不相同。有的转录因子只有一个核定位信号区，该类核定位信号区的碱性氨基酸或者聚集在一起或者形成两个被非保守氨基酸隔开的功能群。而有一的转录因子具有多拷贝的核定位信号区，这些多拷贝 的核定位信号区或者在功能上相互独立，或者成簇存在。 录因子的研究进展 目前研究转录因子功能的方法主要有瞬间 表达 分析、突变分析、以及近年来发展起来的 间表达分析 瞬间表达分析可以较迅速地研究转录因子的 合特性和转录调控特性 （ 激活或抑制 ） （ et 1998） 。转化方法有基因枪、电击法和聚乙二醇法等，在数小时或数天内可以进行测定。这种方法可以快速提供转录因子的 合特性和转录调控特性等信息，根据材料的不同又划分为 植物细胞 （ 或原生质体 ） 瞬间转化分析、酵母细胞瞬间转化分析和动物细胞瞬间转化分析。 能突变分析 与功能基因突变分析相同，转录因子也可以运用功能突变包括缺失突变和获得突变进行分析。以前通过筛选自然突变体来获得基因功能部分丧失的突变植株， 但效率很低，且筛选到的突变体数量有限。现在都采取人工方法，仅 增加了所需突变体的数量，而且可以实现定点突变。 通过 人工获得功能缺失突变体的方法有 T 入突变、转座子插入突变、反义抑制以及 。反义抑制 (是指反向的基因全长或部分序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。由于该序列所表达的 列与其靶 而抑制相应内源基因的表达。共抑制 （ 是指正向的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化，获得转基因植株。转基因植株中该序列所表达的 制了相应内源基因的表达。拟南芥、玉米和矮牵牛都有大量的插入突变体群体。该方法已成功用于分离拟南芥转录因子 因家族的突变体 （ 1999） 。它的主要的局限性在于植物中有一定数量的基因是多拷贝的，有的甚至紧密的串联在一起，通常不易得到目标基因的纯合突变体。双链 是指同时表达的同基因序列的正义和反义 形成的双链 构，它能强有力地抑制相应内源基因的表达。抑制机理目前仍不清楚，但已有证据表明植物中 引起细胞质中同源 解及细胞核中同中国农业科学院硕士学位论文 第一章 前言 4 源基因组 基化，从而使目标基因沉默 （ et 2001） . 转录因子的功能鉴定及突变分析主要利用超表达和 诱导表达 两种 方法 。超表达是指目的基因全长序列与高活性的组成型启动子或组织特异性启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株。应用该方法已经鉴定了一些高等植物的转录因子，但是该方法也有其局限性。基因的超表达会导致致死效应或强烈的多重效应，从而很难从表型中鉴定出所需的转基因植株，即使得到转基因植株，也很难评价其超表达的程度。而基因诱导表达可以实现基因表达的时间控制、空间控制和数量控制，就