【毕业学位论文】（Word原稿）心血管疾病发病机制的深入研究

第一章 前 言 心血管疾病已成为威胁人类生命健康的一个主要问题，最新的研究数据预测，到 2030 年全球将有 2360 万人死于心血管相关疾病 1。由于动脉粥样硬化是导致心血管相关疾病的主要原因 2，因此对其发病机制的深入研究以寻找到可能的防治方法具有重要的意义。 大约在 1900 年，大多数内科医生认为动脉粥 样硬化是年龄的产物。因此，几乎没有相应的治疗和干预措施 3。直到 1913 年， 用一个兔的动脉粥样硬化模型证实，血液高水平的胆固醇是导致此病发生的一个主要原因 4。此后进行了大量关于胆固醇对动脉粥样硬化发生发展影响的实验，目前认为动脉粥样硬化是一个涉及脂质和胆固醇过度沉积在大、中动脉的炎症代谢性疾病。 多种危险因素，主要包括遗传性因素和环境因素可以导致早期动脉血管壁的形态学及功能性损伤，从而促使动脉粥样硬化的发生 5。遗传易感性通常表现为有动脉粥样硬化相关疾病的家族史，同时这些家族的 个体发生动脉粥样硬化的危险增高 6。环境因素主要与个体的生活习惯相关，主要包括高脂饮食，吸烟及缺乏锻炼。在这些危险因素的作用下出现血管内皮功能紊乱、血管炎症，脂质、胆固醇及细胞成分在血管壁内膜下不断聚积，最终导致粥样硬化斑块的形成。 动脉粥样硬化发生的主要初始事件是由于各种危险因素所导致的内皮功能紊乱，包括血管损伤、胶原暴露、脂质和胆固醇沉积于血管壁，或血流速度或压力的改变而导致管壁应力改变等 7。在这些因素中最主要的是 含的脂蛋白，如低密度脂蛋白（ 血管壁内膜下的滞留和积累，当血浆中 平过高时， 会滞留在血管分叉处或血管弯曲的部位 8。这些滞留的 发慢性炎症反应，使内皮功能改变并诱导和释放趋化因子，上调粘附分子 /受体表达，从而将血液中的单核细胞招募到激活部位，此后单核细胞便粘附并迁移至内皮下 9。此外，滞留的 到炎性介质刺激后转化为修饰的脂蛋白，如氧化低密度脂蛋白（ 通过激活内皮导致趋化因子的进一步产生，招募越来越多的单核细胞到达激活部位 10。单核细胞一旦进入内皮下就分化为巨噬细胞，巨噬细胞上的清道夫受体介导摄取沉积及修饰的脂蛋白，最终使巨噬细胞转变为胆固醇富集的泡沫细胞，大量的泡沫细胞便构成了脂肪条纹，此为最早可见的动脉粥样硬化病变 11。随着病变的进一步进展，泡沫细胞内过度积聚的脂质，尤其是游离胆固醇导致细胞毒性，其可诱导特异性细胞因子释放并引发泡沫细胞死亡。泡沫细胞的死亡导致了由脂质、胆固醇结晶和细胞碎片构成的坏死核心，同时释放到细胞外的细胞内容物持续的刺激维持着 一个慢性炎症状态，进一步促使巨噬细胞迁移到内膜区域，从而引发恶性循环 12。 鉴于泡沫细胞在动脉粥样硬化的发生发展中起到的关键性作用，通过对巨噬源性泡沫细胞形成过程的干预来阻止粥样斑块的形成，对防治动脉粥样硬化具有重要意义。泡沫细胞形成过程中细胞内正常胆固醇代谢机制失衡， 胞内胆固醇代谢涉及到胆固醇的合成、流入及流出过程，巨噬细胞内的 酰基辅酶 A 胆固醇酰基转移酶 1（ ， 及细胞膜上 合盒转运蛋白 1（ of ， 参与细胞内胆固醇的调节。 与细胞内胆固醇存在形式的调节，使吞噬进入细胞的游离胆固醇转化为胆固醇酯；而 与细胞内胆固醇含量的调节，可以将细胞内过多的胆固醇移出细胞外。在正常生理状态下，它们可以维持细胞内胆固醇的代谢平衡，但当细胞胆固醇大量聚集时，这种稳态机制不堪重负，巨噬细胞内 胆固醇的流入流出过程失衡，从而使巨噬细胞内胆固醇大量聚集，最终导致泡沫细胞的形成 10。胆固醇逆向转运（ 程是对抗细胞内胆固醇聚集的主要机制，此概念最初由 出 13，指将肝外组织和细胞的胆固醇转运至肝，由肝脏转化为胆汁并从粪便排出的生理过程。 认为 对抗动脉粥样硬化的一个保护性机制 14，而起始步骤是巨噬细胞内的胆固醇流出 15，因此 促进巨噬细胞的胆固醇逆向转运过程，减少细胞内胆固醇的聚集，可能抑制泡沫细胞的形成。 研究发现 泡沫细胞胆固醇逆行转运均有影响 16, 17，通过调节巨噬细胞的 表达，来促进巨噬源性泡沫细胞的 程，可能抑制泡沫细胞的形成。 噻唑烷二酮类药物（ 括曲格列酮，罗格列酮和吡格列酮，为过氧化物增殖物激活受体 (，人工合成配体 18。 一个亚型，属于配体调控的转录因子，其在脂肪代谢和糖代谢中有着重要的作用 19。 受体形成异二聚体并绑定在特定的 而调节靶基因的转录 20。在临床上噻唑烷二酮类药物主要用于 2型糖尿病的治疗，近来有关 动物模型的数据显示罗格列酮能够抑制动脉粥样硬化斑块的形成 21，但其机制尚未明确。一些研究显示罗格列酮可能的抗动脉粥样硬化机制包括改善内皮功能 22、促进脂质代谢 23, 24、抑制炎症 25和增加斑块的稳定 26等。基于动脉粥样硬化发生机制的复杂性，我们在目前的研究基础上进一步探讨罗格列酮抗动脉粥样硬化的机制。 本实验通过将 察罗格列酮 对巨噬源性泡沫细胞内胆固醇含量及 讨其可能的细胞水平的机制，以寻找罗格列酮对抗动脉粥样硬化的潜在靶点。 第二章 材料与方法 1 实验主要试剂和设备 要试剂 小鼠单核巨噬细胞株 中科院上海细胞库） ； 胎牛血清 （ 杭州四季青生物制品公司， 批号： ； 糖培养基（含葡萄糖 4.5 g/L） （ 美国 司，批号： ； 氧化低密度脂蛋白 （ 广州奕源生物科技有限公司，批号： ； 罗格列酮 （ 美国 司，批号： ； 总胆固醇试剂盒 （ 北京普利莱生物科技有限公司，批号： ； 游离胆固醇试剂盒 （ 北京普利莱生物科技有限公司，批号： 兔抗人 体 （ 美国 司，批号： 兔抗人 体 （ 美国 司，批号： 体 （ 上海丰翔生物公司，批号： 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体 （ 上海丰翔生物公司，批号： 剂 （ 美国 司，批号： 34077）； 细胞蛋白提取 解液 （ 美国 司，批号： 白浓度测定试剂盒 （ 美国 司，批号： 23277）； 要设备 超净工作台 （ 苏州净化仪器厂 ）； 二氧化碳细胞培养箱 （ 美国 司 ）； 高速离心机 （ 上海安亭 科学仪器厂 ）； 电热恒温培养箱 （ 成都红星电烘箱厂 ）； 倒置显微镜 （ 日本 司 ）； 自动酶标仪 （ 美国宝特 司 ）； 电泳槽 （ 美国 司 ）； 转膜仪 （ 美国 司 ）； 恒温水浴箱 （ 北京西城区医疗机械厂 ）； 电子天平 （ 上海天平仪器厂 ）； 冰箱 （ 青岛海尔股份有限公司 ）； 超声波清洗机 （ 宁波新芝生物科技有限公司 ）； 手提式不锈钢蒸汽消毒器 （ 上海医疗器械厂 ）； 要实验材料 250 胞培养瓶， 6 孔细胞培养板， 96 孔细 胞培养板， 10 管， 10 1.5 心管， 1.5 存管，加样器及吸头， 250 100 10 璃瓶，定性滤纸， 氏滤器，酒精灯等。 2 实验方法 胞培养及建立泡沫细胞模型 制培养基 1）将一瓶 糖型培养基（含葡萄糖 4.5 g/L）粉剂， 3.7 g 碳酸氢钠溶解于双蒸水中，待完全溶解后用双蒸水定容至 1 L； 2） 4 下保存； 3）灭活胎牛血清，具体方法为将 保存的胎牛血清在室温下完全溶解，置于 56 水浴箱内轻轻晃动 30 活； 4）配制完全培养基，成分为 89 滤后的 养基，加入 10 00 U/青霉素和链霉素。 胞培养 参照文献方法 27，使用含有 10%胎牛血清的 噬细 胞。将细胞置于 37 下，通以 95%空气及 5% 合气体的细胞培养箱中维持培养。当细胞贴壁达 70% 80%时进行传代。 胞传代 当细胞贴壁达 70% 80%时，为防止细胞因生长空间不足或因细胞生长密度过大而导致营养障碍，影响细胞生长，需要将细胞由原培养瓶分离稀释后传到新的培养瓶内以维持细胞的生长。细胞传代的具体步骤为： 1）弃去培养瓶内的培养液，使用 冲液洗涤培养瓶内细胞 3 遍，以去除残留的培养基； 2）用加样器取 酶 1 入培养瓶，并置于 37培养箱内使其与细胞充分作用 5 3）达到消化时间后，在培养瓶内加入含血清的完全培养基已终止胰酶的消化，并按顺序依次吹打瓶底细胞使形成细胞悬液； 4）将细胞悬液移至 10 心管内，高速离心， 1000 4 5）离心好后，弃去上清液，加入完全培养基并重新吹打制成细胞悬液，调整细胞密度后接种至新的培养瓶内。 胞冻存 1）选择生长良好的贴壁细胞并在冻存前一天给细胞换液； 2）弃去原来的培养液，用 涤细胞 3 遍后，加入 蛋白酶 1 照传代的方法将细胞收集与离心管内离心， 1000 4 3）离心后，去除上清液，加入配制好的冻存液，冻存液中完全培养基、胎牛血清、 比例为 7:2:1，将细胞吹打均匀后移入冻存管内； 4）严密封口且做好标记的冻存管依次在 冰箱放置 2 h， 冰箱放置2h，液氮口放置过夜后投入液氮中进行长期保存。 胞复苏 1） 从液氮罐中取出冻存管，用镊子夹住瓶口，在预先调至 37 39 的水中轻轻晃动使溶解，时间控制在 1 2 ； 2）配制好复苏细胞的培养液，成分为 8 2 牛血清及终浓度为 100 U/ 青霉素和链霉素； 3）将复苏的细胞加入配制的培养液中，记好复苏时间，放入细胞培养箱内； 4）次日对复苏细胞进行更换培养液，以去除残留 治其对细胞的副作用。 沫细胞模型的建立 参照文献方法 28，取生 长良好的贴壁细胞，弃去细胞液，加入 全培养基和终浓度为 30 同孵育 48 h 使其转化为泡沫细胞。细胞内胆固醇酯 /总胆固醇比值大于 50%界定为造模成功 29。 沫细胞油红 O 染色鉴定 1）配制油红 O 储存液：取 0.5 g 油红 O 粉剂溶于 100 丙醇中，在 4下避光保存； 2） 弃去模型细胞内的培养基，用 细胞洗涤 3 遍； 3）加入 4%多聚甲醛，固定细胞 30 4）用去离子水稀释油红 O 储存液，比例为 3 红 O 储存液中加入 2 释后的油红 O 染液用滤纸过滤以去除杂质； 5）在细胞中加入油红 O 染液，并在 37细胞培养箱内放置 30 6）弃去细胞中的染液，用 75%酒精洗涤 1 遍细胞，显微镜下观察染色结果。 验分组 实验分为 5 组： 空白对照组，将巨噬细胞培养于含 10%胎牛血清的 于细胞培养箱内不做其他处理； ，用终浓度为 30 的 入完全培养基中，孵育巨噬细胞 48 h； 30 罗格列酮组，用终浓度为 5 的罗格列酮预孵巨噬细胞 2 h 后，加入终浓度为 30 的 8 h； 30 0 罗格列酮组，用 10 的罗格列酮预孵 2 h，其他操作同前； 30 0 罗格列酮组，用 20 的罗格列酮预孵 2 h，其他操作同前。 胞内总胆固醇及游离胆固醇测定 按胆固醇检测试剂盒说明书操作，具体步骤如下： 1）弃去细胞培养液，用 冲液洗涤细胞 3 遍； 2）洗涤后的细胞中加入细胞裂解液，加入比例为每 106 个细胞中加入 0.1 加样器反复吹打，使细胞充分裂解； 3）将细胞裂解液移入 1.5 心管中，高速离心（ 2000 5 收集离心后上清液用于酶学测定； 4）配制游离胆固醇和总胆固醇工 作液，成分为 剂和 剂，配制比例为 2=4:1，混合后立即使用； 5）在 96 孔板的微孔中加入 10 L 样品上清液和 190 L 工作液，置于 37细胞培养箱内 20 其充分反应； 6） 酶标仪测定各孔 ，绘制标准曲线计算总胆固醇及游离胆固醇浓度。 测 蛋白表达水平 剂的配制 液 250 .0 g 用 200 馏水溶解，用浓盐酸调节 所需点后，用蒸馏水定容至 250 各 浓硫酸需要量 17 16 15 10 0 g 100 丙醇溶解，分装于离心管中， 存； 0.2 12 g 500 馏水溶解，高压灭菌后室温保存； 0.2 71.6 g 1000 馏水溶解，高压灭 菌后室温保存 10% 50水浴下 ， 10 g 蒸馏水溶解，并定容至 100 温下保存； 10%过硫酸铵（ 0.1 g 过硫酸铵用 1.0 纯水溶解， 4下可保存一周； 1.5 g 200 纯水溶解，浓盐酸调 纯水定容至 250 压灭菌后室温保存； 0.5 g 200 纯水溶解，浓盐酸调 纯水定容至 250 压灭菌后室温 保存； 10 冲液： 80 g 2 g 14.4 g 2.4 g 蒸馏水溶解，浓盐酸调整 馏水定容至 1 L，高压灭菌后室温保存； 20% 0 蒸馏水定容至 100 4下保存。 用液 30%丙烯酰胺溶液： 29 g 丙烯酰胺加 1 g 甲叉双丙稀酰胺，用去离子水定容至 100 光室温保存； 10%过硫酸铵： 1 g 过硫酸胺加入 10 离子水， 存； 8 g 0.2 g g g 蒸馏时溶解，浓盐酸调整 馏水定容至 1 L，高压灭菌后室温保存； 18.2 g 离子水溶解，加 离子水定容至 100 1M g 离子水溶解，加 离子水定容至 100 10蛋白电泳缓冲液： 30 g 144 g 甘 氨酸， 10 g 离子水定容至 1000 2 白上样缓冲液： 5 .5 加入 4 0%14 0%甘油， 4 酚蓝； 马斯亮蓝 液： 0.5 g 考马斯亮蓝 于 125 醇，加入 35 酸，去离子水定容至 500 避光室温下保存； 蛋白转移缓冲液： g g 甘氨酸， 100 0%甲醇，去离子水溶解并定容至 500 封闭液： 5 g 脱脂奶 粉，溶于 100 制成含 5%脱脂奶粉的 冲液； 冲液： 8.8 g 加入 10 馏水定容至 1000 冲液： 0% 加入 700 匀。 验步骤 白提取及蛋白含量测定 1）弃去培养瓶中的培养液，加入 4预冷的 冲液，洗涤 3 遍，以去除残存培养基； 2）洗涤好的细胞中加入 胞裂解液同时加入苯甲基磺酰氟（ 比例为 1胞裂解液中加入 10 L 待细胞裂解完全后，用刮刀将细胞刮下，将含有细胞碎片的裂解液均移至 1.5 心管内； 3） 4下超速离心， 12000 5 4）收集蛋白样品上清液， 测定蛋白浓度。 胶 制胶方法：固定好电泳玻璃板，根据样品蛋白选择 10%（ 8%（ 分离胶，加入分离胶后再在胶上加一层水，待胶凝固后吸出上层水，再在分离胶以上空间内加入浓缩胶，加完后立即在浓缩胶中插入梳子，待浓缩胶凝固后小心拔除梳子。 不同浓度胶的配方 ： 10%分离胶（ 10 取 3.3 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%过硫酸铵， 4 馏水， 匀； 8%分离胶（ 10 取 2.7 0%丙烯酰胺，加入 2.5 0.1 0%0.1 0%过硫酸铵， 4.6 馏水， 匀； 5%浓缩胶（ 5 取 0%丙烯酰胺，加入 0%0%过硫酸铵， 3.4 馏水， 匀； 注：加入 立即混匀灌胶。 泳 1）将收集的蛋白样品加入 2 白上样缓冲液， 100加热 5 蛋白变性； 2）待胶凝固后将玻璃板固定于电泳槽中，加入电泳缓冲液，再加入处理的变性蛋白样品，接通电源，先稳压 80V 30 调电压至 1100 膜 1） 提前将电泳好的凝胶，滤纸，海绵垫浸泡于电转缓冲液中； 2） 取一块 ，依次作如下处理： 100%甲醛中浸泡 10 秒，去离子水中浸泡 3 转缓冲液中浸泡 3 3）在装有电转缓冲液的转膜槽中放入电转三明治，顺序依次为：转膜槽正极，海绵，滤纸， ，凝胶，滤纸，海绵，转膜槽负极，注意赶出气泡。放好后加盖，接通电源进行转膜， 整电流至 200 膜 150 整电流至 25 膜 17 h； 4）将转膜后的 置于含 5%脱脂 奶粉的 冲液中封闭 2 h。 体孵育 1）转移膜加入 10 抗， 4下孵育过夜， 冲液洗涤 3 遍； 2）加入 15 抗，室温下孵育 2 3 h， 冲液洗涤 3 遍。 学发光，显影及图像分析 1）配制 ， 1 液（ A 液）和 1 液（ B 液）混合后即可使用； 2）避光下用 浇膜，冲洗膜大约 10 次左右； 3）将膜放入夹片中， X 线曝光拍照； 4) 像分析软件分析结果，用样品蛋白的面积灰度值分别与 灰度值比较，比值为样品蛋白的相对表达水平。 计学处理 采用 件系统进行数据分析，所有数据用均数标准差（ x s）表示，两组之间比较采用 t 检验，大于两组比较采用单因素方差分析。当 P S in . J 2000, 275(29): 2243541 , , G, et a a . 2005, 54(3): 81142 , , , et in J. J 2007, 321(2): 43143 , , L, et in . 2004, 24(2): 25744 J, . in . 2010, 7(2): 7745 , , , et of of in . 2009, 203(2): 48346 J, G, T, et of in . J 2006, 116(1): 5947 , , , et .