【毕业学位论文】（Word原稿）Notch信号通路介导人胃癌细胞株BGC-823凋亡的机制

兰 州大学硕士研究生学位论文 1 前言 胃癌是世界范围内的常见肿瘤，占全世界死亡率的第二位 1。有学者统计，全世界的胃癌患者有 52%分布在亚洲， 41%在中国 2。在我国胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的身体健康和生活质量。手术是治疗 胃癌最有效的方法，但由于胃癌起病隐匿，早癌诊断困难，很多患者在发现时已经失去了手术机会。对于失去手术机会的晚期患者及术后复发不能再进行二次手术的患者，化疗成为最有效的治疗方法，但其毒副作用使得预后并不乐观。寻找新的治疗方案迫在眉睫，挖掘肿瘤发生发展的分子机制才能另辟出路。 传统的观念认为，肿瘤的发生是细胞过度增殖和异常分化的结果，近有研究表明，肿瘤的发生和发展还与细胞的凋亡密切相关 3, 4。近年来出现的部分放化疗等治疗肿瘤的方法都基于细胞凋亡的分子机制 5, 6。细胞凋亡是指在体内外生理或病理因素诱导下，由基因严格调控而发生的自主性细胞有序死亡，故又称程序性细胞死亡。细胞凋亡的生物学意义在于：清除生长发育过程中多余或老化的细胞，确保正常的生长发育；参与正常成年组织的细胞更新以及对损伤不能修复的细胞或突变细胞的清除等重要生理过程，维持机体内环境稳定。正常情况下，细胞的增殖与凋亡保持着一种动态平衡，这种平衡的维持有赖于凋亡诱导基因和抑制基因的平衡。细胞凋亡不足或过度都会引发疾病，如阿尔兹海默病由神经细胞凋亡过度引起 7，而肿瘤的发生就与细胞凋亡不足密切相关。目前已发现的凋亡途径主要有外源性的死亡受体途径、内源性的线粒体途径以及近年来发现的内质网途径 8。死亡受体途径的激活起始于死亡配体与以肿瘤坏死因子受体（ 族（ ）为主的死亡受体的结合。配体受体结合后，受体胞浆部分的死亡结构域相互聚集，吸引衔接蛋白并募集 集后的 活下游的 6， 7，促发 导细胞凋亡 9, 10。线粒体途径的激活是在某些凋亡刺激因素如 物、射线等促使线粒体释放细胞色素 C（ ， ），在 凋亡诱导蛋白酶激活因子（ 合并募集 促使 身活化，再激活效应 发细胞凋亡 11。 自 1919 年 2首次在果蝇中发现 因以来，大量研究表明号通路广泛存在于从无脊椎动物到哺乳动物的多个物种，进化上十分兰 州大学硕士研究生学位论文 2 保守，在细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动中发挥重要的作用 13。 号通路由受体、配体和 部分组成。哺乳动物中有 4个同源 个同源配体 有的同源 型跨膜蛋白，由胞内区、跨膜区和胞外区组成。 号通路的激活主要有两条途径： 赖途径和非 典的 三步裂解法 )：无活性的 体从高尔基体中合成后向细胞膜表面转运，被 1位点酶切为胞外部分、跨膜及胞内部分两个亚基，共价结合为异二聚体表达在胞膜上。异二聚体胞外部分的表皮生长因子样重复序列主要功能是与配体结合。受体的胞外部分与邻近细胞表面的配体结合后，在点被 金属蛋白酶切割，胞外部分被胞吞作用产生的机械力拖动到配体表达的细胞中，剩余部分则在跨膜区 放活化片段 基因。 号通路与肿瘤的关系最早发现于 T 淋巴细胞白血病 14，随后的研究中发现， 乳腺癌 15前列腺癌 18, 19、肺癌 20, 21、皮肤癌 22, 23、肝癌 24, 25、胰腺癌 26, 27、胃癌 28。除此之外，大量的研究发现 号通路根据不同的组织类型和细胞背景在不同的肿瘤中发挥的作用也不相同。例如 乳腺癌中扮演原癌基因的角色，且 31；在皮肤癌 32和肝癌 33中 胰腺癌发生的过程中 号通路阻止肿瘤的生成，而在其发展的过程中 号通路则有促癌的作用34。到目前为止， 号通路的活化对胃癌细胞的影响还不十分明确，其分子机制还有待进一步验证。 以切割多种 I 型跨膜蛋白如 白家族、 35。近年来因其切割 生的 得 体释放活化片段在 路激活过程中是最为关键的一步，因此 号通路的活化，为治疗 有大量的研究以 号通路影响肿瘤发生发展的分子机制，证实 够抑制 36 基于上述研究，我们设想 号通路可能通过死亡受体途径、线粒体途径或者其他途径调控 人胃癌细胞株 的凋亡。为此，我们采用不同浓度的 大学硕士研究生学位论文 3 泌酶抑制剂 预 人胃癌细胞株 用 式细胞术、 实时荧光定量 方法检测 胞的凋亡率以及析三者之间的关系，探讨 胃癌细胞株 明其可能的机制。相信我们的研究有助于进一步验证 号通路在人类胃癌发生发展过程中的生物学作用，为胃癌的治疗和预防提供新的理论基础。 N o t c h - 1 调控胃癌细胞凋亡的可能机制及研究设想N ot c h - 1 细胞凋亡率 死亡受体途径线粒体途径兰 州大学硕士研究生学位论文 4 材料与方法 一、材料 1、胃癌细胞株 购于 中国科学院上海生命科学研究院 2、主要试剂 细胞培养 用胎牛及新生牛血清 杭州四季清公司 养基 司 胰蛋白酶 二甲基亚砜（ 、合成 x 氯仿 天津市北辰方正试剂厂 异丙醇 天津市红岩化学试剂厂 无水乙醇 天津富宇试剂厂 北京普利来公司 牛血清白蛋白（ 30%丙烯酰胺 北京普利来公司 上海生工 甘氨酸 上海生工 二烷基硫酸钠 ) 上海生工 兰 州大学硕士研究生学位论文 5 硫酸铵 ) 上海生工 上海生工 溴酚蓝 上海生工 巯基乙醇 上海生工 上海生工 蛋白 上海生工 上海生工 兔抗人 单克隆抗体 兔抗人 多克隆抗体 兔抗人 兔抗人 杭州贤致公司 辣根过氧化物酶 (记的羊抗兔 北京普利来公司 脱脂奶粉 北京普利来公司 显影粉 北京中衫公司 定影粉 北京 中衫公司 超纯水 兰州大学第一医院制备 3、主要仪器 光学显微镜 日本 超净工作台 苏净安泰 数字可调微量移液器 日本立洋 4 20 80 子天平 S 400S 低温高速离心机 上海医疗器械七厂 超纯水设备 00型酶联免疫分析仪 美国 流式细胞仪 美国 兰 州大学硕士研究生学位论文 6 核酸蛋白定量仪 通用公司 美国 实时定量 微量进样器 上海生工 胶板 北京六一实验仪器厂 电泳仪 北京六一实验仪器厂 垂直电泳槽 北京六一实验仪器厂 半干式电转移槽 北京六一实验仪器厂 脱色摇床 北京六一实验仪器厂 4、主要溶液配制 超纯水按说明配制，调 100U/ 100U/ 10%胎牛血清， 4 保存备用。 .2 g， .0 g， . 2 g， 2O g，加超纯水定容至 1000 121 ，高 压灭菌 30 胰蛋白酶 00 4 保存备用。 细胞冻存液 1 2 4 保存备用。 称取粉剂 g，溶于 30 分溶解后过滤除菌，分装于 1.5 避光保存备用。 量取 .1 00 合均匀后 ， 121 高压消毒 30 然冷却后， 4 保存备用。 10 ） 称取 g，溶于 10 解后分装于 1.5 20 保存备用。 10%取 g，加入 100 50 水浴溶解后室温保存。 兰 州大学硕士研究生学位论文 7 10%过硫酸胺（ 称取过硫酸胺 0.1 g，溶解于 1 4 保存备用，保存时间为 1周。 称取 g，溶于 100 浓 温高压灭菌备用。 称取 g，溶于 100 浓 温高压灭菌备用。 称取 g，溶于 100 浓 温高压灭菌备用。 10电泳缓冲液 称取 g，甘氨酸 g， g，溶于 500 温保存，使用时稀 释 10倍。 10取 8 g，取 200 于1000 4 保存，使用时稀释 10倍。 2阳极缓冲液 I（ 称取 g，取甲醇 100 于 500 温保存，使用时稀释 2倍。 2阳极缓冲液 25 m M 称取 g，甲醇 100 于 500 温保存，使用时稀释 2倍。 4阴极缓冲液（ 25 0 称取 g，甘氨酸 6 g，取甲醇 200 于 500 温保存，使用时稀释 4倍。 5取 .5 g，溴芬蓝 25 巯基乙醇 25 l，甘油 2.5 超纯水定溶至 5 分混匀后分装于 1.5 4 保存备用。 封闭液 称取脱脂奶粉 0.5 g，溶于 10 用现配。 抗体封闭液 分别将各种一抗、二抗按一定的稀释比例加入上述封闭液，使用后回收至兰 州大学硕士研究生学位论文 8 离心管 保存以重复使用。 10丽春红染液 称取丽春红 2 g，磺基水杨酸 30 g，三氯乙酸 30 g，溶于 100 用时稀释 10倍。 显影液 先将小袋药粉溶于适量水中， 50 水浴搅拌充分溶解后，再将大袋药粉加入至全溶，定容至 ，静置 12小时后使用，不用时加盖保存。 定影液 先将药粉徐徐加入 40 水中搅拌至充分溶解，再定容至 ，冷却至 18 后即可使用。 1 1 4 分混匀后备用。 溶解 5 mg/I 5 分混匀后备用（未用完的工作液 4 保存后用）。 75%乙醇 取 15 入 5 分混匀后备用。 二、方法 1、细胞培养 人胃癌细胞株 0%胎牛血清、青霉素 (100 U/链霉素 (100 U/ 37 、 5% 5%空气的培养箱中。 胞传代 代前准备 培养用液复温：把装有 已经配制好的培养液、 胰蛋白酶的瓶子放入 37 水浴锅内预热。 以 75%酒精棉球擦拭双手和紫外线照射 30 正确摆放需要使用的器械：确保足够的操作空间，既便于操作又可减少污染。 兰 州大学硕士研究生学位论文 9 点燃酒精灯：注意酒精灯内酒精不得超过酒精灯最大容量的 2/3，不少于1/3，火焰不能太小。 将消毒后的空培养瓶放入微波炉内高火、 8 将已复温的培养用液取出：将已经预热好的培养用液取出，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 将细胞从培养箱内取出：注意细胞取出时要旋紧瓶盖，先用酒精棉球擦拭显微镜的台面后，再在镜下观察细胞。 打开培养用液及细胞培养瓶瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 蛋白酶消化 加入胰蛋白酶消化液：先将旧培养液小心吸出，用 洗）后加入适量消化液（胰蛋白酶液）。注意加入的消化液的量以盖 住细胞最好，最佳消化温度为 37 。 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞，如胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明细胞已消化适度。 吸弃消化液加入培养液：吸弃胰蛋白酶液，加入含胎牛血清的新鲜培养液，注意更换吸管。 打分散细胞 吹打制悬：用尖吸管将消化后的细胞吹打成细胞悬液。 吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入 10 平衡离 心：天平配平后将离心管放入台式离心机中， 1000 心 6-8 吸弃上清液，加入新培养液：吸弃上清液，加入 2 滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 装稀释细胞 分装：用滴管将细胞悬液吸出，分装至 2 3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要时计数。注意传代细胞的密度应该不低于 5105/ 度过小会影响传代细胞的生长。 续培养 用酒精棉球擦拭培养瓶，旋松瓶盖 1入 胞的冻存 取生长状态良好的细胞按上述步骤制成细胞悬液，离心洗涤后，加入冻存兰 州大学硕士研究生学位论文 10 液中，细胞终密度为 5106/ 5107/ 吸管轻轻吹打均匀，然后分装入无菌的冻存管中，每管 1 1.5 封冻存管，标明细胞名称、冻存时间，装入已作标记的小袋，先放入 4 冰箱约 40 着置于 冰箱约 30 60 于 超低温冰箱中放置过夜，最后放入液氮罐中长期保存。 胞的复苏 提前打开水浴锅，预热至 37 。以 75%酒精棉球擦拭双手和紫外线照射30 培养用液复温：把装有配制好的培养液的瓶子放入 37 水浴锅内预热。 迅速将细胞冻存管从液氮中取出，放入 37 水浴中轻轻摇动至其完全融化。 将冻存管内液体移至 10 入 4 1000 上清。 再加入 5 轻吹打使细胞悬浮， 1000 去上清。 用吸管加入 2 轻吹打将细胞悬浮，再将管内液体移入己加5 0%胎牛血清的 5 将 胃 癌细胞系置于培养箱中， 37 、 5%5%空气常规培养。 隔夜 ，将培养瓶置于显微镜下观察，可见培养瓶中大部分细胞己贴壁，呈不规则形状。 细胞复苏的原则：必须将从液氮中取出的细胞快速融化至 37 ，以避免缓慢融化时产生的冰晶进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 胞计数 实验原理：当待测细胞悬液中的细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中细胞的数目，即可换算出单位体积细胞悬液中的细胞数目。 准备工作 A取一套血球计数板，清洗干净后备用。 B培养用液复温：把装有已经配制好的培养液、 胰蛋白酶的瓶子放入 37 水浴锅内预热。 C以 75%酒精棉球擦拭双手和紫外线照射 30 细胞悬液的制备 兰 州大学硕士研究生学位论文 11 将细胞用 胰蛋白酶液消化、 入适量培养液（或 吹打制成待测细胞悬液。 细胞计数 A盖好盖玻片：将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。 B制备计数用的细胞悬液：将细胞悬液吹打均匀后，吸 100 l 细胞悬液到一 1.5 入 100 或苯胺黑，用于显微镜下区别活细胞和死细胞（活细胞不会被染色）。 C将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹打均匀后，吸取 10 要保证盖玻片下充满悬液，又不能让细胞悬液流入旁边槽中（注意盖玻片下不能有气泡）。 D统计四个大格的细胞数：将血球计数板置于显微镜低倍镜下观察，移动计数板至看到镜中出现计数方格后，数出四角四个大格（每个大格含有 16个小格）中没有被染液染色的细胞数目。 E计算细胞悬液的细胞数：按照下面的公式计算细胞密度 （细胞悬液的细胞数） / 四个大格子细胞数 /4） 2104 说明：公式中乘以 104是因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0 ） 1.0 ） 0.1 ） 0.1 1 1000 式中乘以 2是因为细胞悬液与染液是 1： 1稀释。 公式中除以 4是因为计数了 4个大格的细胞数。 细胞悬液中的细胞要求分散良好，否则影响计数准确性。 细胞计数时，要求细胞悬液中细胞数目不少于 104个 / 果细胞数目过少，需离心后再重悬细胞于少量培养液中 取样计数前应充分混匀细胞悬液，以求计数准确，尤其是多次取样计数时更要注意每次取样前都要吹打均匀。 计数时如细胞压在格线上，则只计上线，不计下线，只计左线，不计右线；只计完整的细胞，若细胞聚集成团，只计一个细胞。 操作时盖玻片下不能有气泡，不能让细胞悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。 2、配药 子量为 加 单瓶药物总量为 5 分溶解混匀，分装于 200 l 储存备用（终浓度为 10000 兰 州大学硕士研究生学位论文 12 ）。 3、 验原理 验即四唑盐比色试验，是一种检测细胞存活和生长的方法。实验所用的显色剂四唑盐化学名 3-（ 4,52） 品名为噻唑蓝，简称 细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 死细胞无此功能。甲臜溶解于二甲基亚砜（ 用酶联免疫检测仪在 490 间接反映活细胞量。在一 定的细胞数范围内， 验分组 在 0 、 1 、 5 、10 、 25 、 50 的 4h、 48h、 72h，重复 3次。 骤 收集对数生长期细胞制成细胞悬液，按上述方法进行细胞计数后，调整细胞悬液浓度为 1104个 / 96孔板每孔加入 200 缘孔用无菌 5%37 环境中孵 育至细胞单层铺满孔底，加入 200 度梯度药物的培养液，每个梯度设 5个复孔，同时设置调零孔（只加培养基，无细胞和药物）。 5%37 环境中孵育至设定时间后，每孔加入 20 l h。 终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入 150 摇床上低速振荡 10 结晶物充分溶解。 在 酶联免疫 检测仪 果分析 取各浓度梯度平行孔 下面公式计算细胞存活率。 细胞存活率 =（实验组 调零组 ） /（对照组 调零组 100% 兰 州大学硕士研究生学位论文 13 4、流式细胞术检测细胞凋亡率 验原理 正常细胞膜磷脂的分布是不对称的，膜内表面含带负电的磷脂（如磷脂酰丝氨酸， 而外表面则含有占绝大多数的中性磷脂。细胞凋亡早期膜内部的磷脂酰丝氨酸（ 迁移到细胞外层表面。 是一种 赖，对 高度亲和力的磷脂结合蛋白，可作为探针识别细胞膜表面是否有 而识别早期凋亡细胞。 一种核酸染料，不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞， 够透过细胞膜而使细胞核着染。因此 ，将 与 配使用，可以将凋亡早期的细胞和凋亡晚期以及坏死细胞区分开来。 （表 1） 表 1 ： 做任何处理，作为对照组。 实验组在 入 5 的 4h、 48h、 72h，重复 3次。 做任何处理，作为对照组。 实验组在 胞株中分别 加入终浓度为 1 、 5 、 25 的 8h，重复 3次。 体操作 胞处理 收集对数生长期细胞制成细胞悬液，按前述方法进行细胞计数后，调整试剂 含量 88 （试剂 A） 250 l 剂 B） 100 l 5剂 C） 15 州大学硕士研究生学位论文 14 细胞悬液浓度为 3105个 / 6孔板每孔加入 3 常规培养细胞至生长到 60%时用无血清 步化处理细胞24h，使所有细胞处于同一生长期，然后按照上述分组加药处理细胞。 5%37 环境中孵育至设定时间后，由于细胞经药物干预会发生凋亡，所以需将原来的细胞培养液和用胰酶消化后的细胞收集在一起， 4 、 1000 0 弃去上清，加入预冷的不含钙离子、镁离子的 细胞吹打均匀后 4 、 1000 0 弃去上清，在离心好的细胞中加入少许 1沉淀吹打均匀，使细胞密度维持在 105胞悬液总量超过 100 l）。 机检测 加 5 88 试剂和 10 100 轻混匀。 避光 室温孵育 15分钟。 再向上述细胞悬液中加入 400 l 1轻吹打，过300目滤网过滤（除去成团的细胞，避免损坏仪器）。 即刻上机检测。 果分析 在流式细胞术双参数散点图上横坐标是 ，纵坐标是 下象限显示活细胞，为（ -/右上象限是晚期凋亡和坏死细胞，为（ +/；右下象限为早期凋亡细胞，显现（ +/ 5、实时荧光定量 验原理 实时荧光定量 的是在 用荧光信号积累实时监测整个 后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其使用的荧光化学可分为两种荧光探针和荧光染料，我们采用的是 链后，发射荧光信号，而无 料分子掺入的 会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 物的增加完全同步。 物设计与合成 兰 州大学硕士研究生学位论文 15 下述引物由 物序列（见表 2） 表 2 待测基因引物序列 55 553 55物配制 确定引物量：即合成引物 如其值为 12.9 配置储存液 :将储存液浓度配 制为 100 ( 此时加入 0=129 l ) 后， 10 配置工作液 :取分装好的 10 0 l 制成 100 l 10 的工作液。 注意：在溶 止引物丢失。 验分组 间依赖性检测： 做任何处理，作为对照组。 实验组在 入 5 的 4h、 48h、 72h，重复 3次。 做任何处理，作为对照组。 实验组在 胞株中分别 加入终浓度为 1 、 5 、 25 的 8h，重复 3次。 胞处理 兰 州大学硕士研究生学位论文 16 收集对数生长期细胞制成细胞悬液，按前述方法进行细胞计数后，调整细胞悬液浓度为 3105个 / 6孔板每孔加入 3 常规培养细胞至生长到 60%时用无血清 步化处理细胞24h，使所有细胞处于同一生长期，然后按照上述分组加药处理细胞。 5%37 环境中孵育至设定时间后，将原来的细胞培养液和用胰酶消化后的细胞收集在一起， 4 、 1000 前开离心机预冷）。 弃去上清，加入预冷的 细胞吹打均匀后 4 、 1000 胞中总 将上述离心后 的细胞弃去上清，转入无 .5 在离心管中加入 1 移液器反复吹吸直到裂解液中无明显沉淀为止（整个操作尽量在冰上进行）。 室温静置 5分钟。 在匀浆裂解液中加入 体积量氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡 15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开），待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置 5分钟。 12000 g、 4 离心 15分钟。 从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机物。吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15 下静置 10分钟。 12000 g、 4 离心 15分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 沉淀的清洗：小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入 75%的乙醇 1 切勿触及沉淀），轻轻上下颠倒洗涤离心管壁， 12000 g、 4 离心 5 分钟后小心弃去乙醇（为了更好的控制 尽量除尽乙醇）。 温干燥沉淀 2可离心或加热干燥，否则 加入适量的 溶解沉淀，必要时可用移液器轻轻吹打沉淀，待 80 保存备用。 用核酸蛋白定量仪测出 度及纯度），当比值小于 要重新提取。 兰 州大学硕士研究生学位论文 17 5.6 在冰上配制 表 3 试剂 使用量 （ l） 5 2 0 每 10 过 500 转录前应按照测得的 反转录反应条件： 37 15 5 5s。 反转录得到的 以分装 保存备用，或者直接进行下一步扩增。 时荧光定量 冰上配制 表 4 试剂 使用量 （ l） x 菌双蒸水） 时荧光定量 95C 10 1 5C 5 60C 30 验结果分析 40 州大学硕士研究生学位论文 18 反应结束后分析熔解曲线，根据熔解曲线是否单峰来判定扩增产物是否单一，以判断产物的特异性。 数据分析： 与样品中起始模板的拷贝数的对数成线 性反比关系（ 的含义是每个标本重复 3次，取平均值为 将目的基因 (的 (行归一化 ( T ，分别获得实验样品 (和对照样品 (的 CT T 和 CT T 。再计算实验样品与对照样品的 CT CT 后，计算样品目的基因的相对表达率 (， -未做任何处理的胞中各目的基因 (的基因表达量为 1， 2- 6、 验原理 已用聚丙烯酰胺凝胶或其他凝胶 电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。固定在滤膜上的蛋白质成分保留抗原活