【毕业学位论文】（Word原稿）中国普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）的遗传多样性研究及栽培稻起源探讨生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士 学位论文 中国普通野生稻（ 的遗传 多样性 研究及栽培稻起源探讨 on of of on of of I 摘 要 普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种 ， 确定普通野生稻的遗传多样性中心 对 探讨栽培稻的起源进化研究和野生 稻保护 均 具有重要意义。本研究中 利用分布于 12 条染色体的 28 个 点 ，对来自全国 6 个省（区） 20 个居群的 628 份 普通野生稻进行分子标记，研究其遗传多样性。结果如下： 1. 在 28 个微卫星位点中共检测到等位基因 406 个。位点 、 I 均较高，能更好的检测居群的遗传多样性。 在 20 个居群按纬度从低到高排列的香农指数 （ I） 、 平均期望杂合度（ 实际观察杂合度（ 趋势 中， 除 几个特殊居群外，北纬 间的居群的遗传多样性比较高，即 海南北部和两广北回归线以南的地区应为 中国普通野生稻 的遗传多样性中心 ，并推测 此地区 也 可能为栽培稻的起源中心。 2. 通过聚类分析和主坐标分析（ 可将 20 个普通野生稻居群大致分为 4 个区域： （ 1）海南南部居群之间遗传关系较近，但各居群间的基因交流受到一定的影响；（ 2）海南北部和两广南部北回归线以南的居群不仅遗传多样性较高，而且遗传关系非常近，是华南的遗传多样性中心；（ 3）湖南和江西的北缘居群及与其靠近的华南北部居群与华南的中心居群之间存在着一定的遗传隔离；（ 4）两广中北部的居群是遗传多样性逐渐降低的地区， 此地区是中心居群与北缘居群的过渡地区，呈现一定的遗传分化状态。 3. 分省（区）的遗传多样性比较结果表明，广西、广东、海南三省（区）是普通野生稻遗传多样性较高的地区，而湖南、江西、福建等省的普通野生稻的遗传多样性则较低。 遗传关系分析结果表明，海南、广西、广东 3 省（区）群体的亲缘关系较近，湖南和江西 2 个群体的亲缘关系较近，而福建群体与其他 5 省（区）群体之间形成了一定的遗传分化。 4. 由于 点 在同一 普通野生稻 材料中出现的谱带数多于 2， 可能存在两个以上的 结合 位点，即引物可能是非特异性的。 为了进一步阐明 该 引物 出现 异常的原因，选取 50 份栽培稻材料 进行研究 。 结果表明 栽培稻也出现了 2 个以上的位点，但其遗传变异水平明显低于 普通野生稻材料。 关键词 普通野生稻 ， 遗传多样性 ， 栽培稻起源 t is of To is 28 0 8 1. 06 8 be to be in TL I), it be N N, It be is of . be . 2. 20 to (1) is (2) I be of (3) II of (4) V is 3. so 4. to be To 0 of in of 录 第一章 绪论 . 1 究的意义和目的 . 1 生稻概述 . 2 生稻的分类系统 . 2 生稻在我国的地理分布 . 4 通野生稻的植物学特征 . 4 通野生稻的生态学特性与生态环境特点 . 5 传多样性研究进展 . 6 传多样性的研究方法 . 6 传多样性的分析方法 . 8 子标记在 遗传多样性研究中的应用 . 11 生稻的遗传多样性研究进展 . 12 培稻起源的探讨 . 13 洲栽培稻起 源地研究进展 . 13 第二章 材料与方法 . 15 料来源 . 15 生稻材料来源 . 15 验方法 . 16 提取 . 16 增所用引物的获得 . 17 丙烯胺凝胶电泳检测 . 18 据分析方法 . 20 据统计 . 20 传多样性分析 . 20 体遗传关系分析 . 20 体聚类分析 . 20 坐标分析 . 20 第三章 结果与分析 . 21 居群的遗传多样性分析 . 21 位点在总居群上的遗传变异 . 23 居群间的遗传关系 . 25 传一致度 . 25 群间聚类分析 . 25 居群间的主坐标分析 . 28 有个体聚类分析 . 30 省普通野生稻群体的遗传分析 . 31 省普通野生稻群体的遗传多样性分析 . 31 省普通野生稻群体间的遗传关系 . 31 省普通野生稻群体内的遗传关系 . 33 培稻与野生稻的遗传变异水平比较 . 35 第四章 讨论 . 38 传多样性的地理特征 . 38 南 气候条件最合适的分布区 . 38 州半岛 大陆最南端的居群 . 38 回归线 遗传多样性的分界线 . 38 缘居群 具特殊保护价值的分布区 . 39 建漳浦 探索台湾野生稻的桥梁 . 39 国普通野生稻遗传多样性中心与栽培稻的起源 . 39 第五章 全文结论 . 42 参考文献 . 43 致谢 . 49 附录 . 50 作者简历 . 54 0 英文缩略表 英文缩写 英文全称 中文名称 氧核糖核酸 糖核酸 使核糖核酸 合酶链式反应 机扩增的多态性 制性酶切长度多态性 增的限 制性片段长度多态性 单重复序列 A of 均等位变异数 Ae of 效等位变异数 He 均期望杂合度 Ho 际观察杂合度 I 农 多样性指数 I 传一致度 二烷基磺酸钠 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究的 意义和目的 作物种质资源， 是指 携带各种遗传物质 基因的栽培植物及其野生近缘植物，亦称作物遗传资源，包括种、品种、品系和类型，及其野生近缘植物 （刘旭， 2003） 。作物种质资源科学研究工作内容包括考察收集、起源演化、分类、国外引种检疫、保存保护、鉴定评价、种质创新、分发利用和信息管理。作物种质资源是人类生存和发展的战略性资源。作物种质资源不仅为 人类衣食提供了原料，为人类健康生活提供了重要的营养品和药品资源，而且还提供了良好的生态环境。作物种质资源为植物新品种的选育和开展生物技术研究提供了取之不尽的基因来源。作物种质资源的急剧减少甚至灭绝，对我国作物生产和育种的长远发展带来了不可估量的负面影响，对生态环境和安全的破坏也是致命的，无法挽回的。物种的消失，意味着这些物种所携带的遗传基因随之消失，而目前人类还不能创造这些基因，这将大大增加自然生态环境的脆弱性，并将大大降低自然界满足人类需求的能力。作物种质资源 研究的一个重要问题就是遗传多样性的研究。 遗传 多样性 ， 广义上 是指 蕴藏在地球上的植物、动物和微生物个体的基因中遗传信息的总和（李文军， 1992） 。狭义上，主要指种内不同群体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和 （ 1992） 。遗传多样性的本质是生物体在遗传物质上的变异，即编码遗传信息的核酸（ 组成和结构上的变异。 因此，遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史 (起源的时间、地点、方式 ),也能为进一步分析进化潜力和未来的命运提供 重要资料 （ ， 1991）。物种 的遗传变异愈丰富，对环境适应性愈广，也就是说群体内的遗传多样性 反映了物种的进化潜力。 物种内的多样性是物种以上各水平多样性的重要来源，遗传变异、生活史特点、种群动态及其遗传结构等决定或影响这一个物种与其他物种及环境之间相互作用的方式。而且种内遗传多样性是一个物种 对 人为干扰能否成功的反应的决定因素 （陈灵芝等， 2001） 。因此，遗传多样性的研究有益于正确制定植物遗传资源收集和应用的策略 ， 还可为 拓宽育种的遗传基础 ,增强育成品种对病虫害与不良环境的抗性 提供理论指导。 作物种质资源研究中对于遗传多样性的研究主要在两方面，即物种多样性和遗传多样性。野生稻资源多样性研究主要集中在种内 遗传多样性，兼顾生态系统多样性与物种多样性以及遗传多样性的保存技术研究。在制定收集和原位保存策略时要考虑到等位基因的丰富程度，保持群体内的杂合性，可见对于遗传多样性的研究就十分重要 （庞汉华等， 2002） 。 普通野生稻是水稻种质资源研究中的重要内容。 栽培稻的祖先是普通野生稻（ 这一理论已被人们所公认 （李道远等， 1993；王象坤， 1996） 。但是，究竟起源地在哪里，演化途径又是如何，存在着不同的观点。在讨论解决这个问题时，野生稻活的标本 、 分布地生态环境 、 居群的遗传结构 以及考古中野生稻的出土样品都是有力的证据。由此看来，野生稻在栽培稻起源演化研究中有着重要的意义。 为了论证 中国 普通野生稻的遗传多样性中心问题及栽培稻的起源地问题，本研究 拟通过对来中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 自全国 不同纬度 20 个居群 的普通野生稻 （ 进行遗传多样性研究，确定 中国 普通 野生稻的遗传 多样性 中心并探讨 栽培稻 的 起源 中心 。 生稻概述 生稻的 分类系统 植物学家们将所有的植物分类为科 （ ， 科下再细分为亚科 （ 、族 （ 、属 （ 、种 （ 等。 按照目前分类体系，野生稻是指稻属中的所有物种。 稻属 （ 禾本科 （ 中一个很重要的属，是由 1753 年首先创立的。 19 世纪末， 1894） 对稻属植物进行了详细研究并第一次对稻属进行了系统的分类处理，他将当时的稻属界定为 5 个种，并将其划分在 4 个组中 ， 即 含 O. ， 含 O. ，含 O. 以及 含 O. O. 。而在 1922） 的稻属分类中 ， 种的数目已增至 16 个。俄国著名分类学家 1931）在对稻属的大量植物标本和资料进行了仔细查阅和研究之后，对稻属的分类作了非常系统的整理和订正，并对多个种配以插图进行了详细的描述，建立了一个新的稻属分类系统，该系统包含了20 个种 ， 归于 4 个组，其中最大的 含 12 个种， 有 2 个种， 含了 5 个种，而 仅含 1 个种。 1989） 建立了一个 包含4 个复合体的稻属分类系统。这个系统包含了 22 个种 ， 分别归属于 O. 合体 （ 含 8 个种 ） ，O. 合体 （ 含 8 个种 ） ， O. 合体 （ 含 2 个种 ） 和 O. 合体 （ 含 2 个种 ） 。但是，他未将另 2 个种 O. O. 入任何复合体中。 1999） 在研究了 1931） ， （ 1965） ， 1989） 稻属分类系统的基础上，结合现代已发表的稻属分类学资料 ， 提出一个 3 组 7 系 24 种的稻属分类系统。这一分类系统的最大一个组 括了 含 8 个种 ） ， 含 1 个种 ） 和 含 8 个种 ） 。第二个组 含 3 个种 ） ， 含 2 个种 ）和 含 1 个种 ） 这 3 个系构成。 随后，一些稻属中存在的问题相继被澄清。卢宝荣等（ 2001） 根据对稻属的不同分类系统以及目前对稻属研究资料的积累和分析 得到分类系统如 表 1。 这一分类系统既合理地反映了目前稻属的物种数目及其种间关系，同时也在很大程度上支持了形态学、细胞学和分子生物学对稻属各物种研究的结果。 表 1：稻属的分类系统及各物种的染色体数、染色体组和地理分布 of in 类群 2n 基因组 分布 . 1. 颗粒野稻 24 亚 ,东南亚 O. 国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 新喀里多野稻 24 喀里多尼亚 O. . 长颖野稻 48 尼伊里安查亚 ,巴布亚新几内亚 O. 来野稻 48 亚 O. . 西来特野稻 48 布亚新几内亚 ,印尼伊里安查亚 O. . 4. 短花药野稻 24 洲 O. . . 5. 高杆野稻 48 丁美洲 O. 穗野稻 24,48 南亚 ,东非 O. 颖野稻 48 丁美洲 O. 叶野稻 48 丁美洲 O. 蓝普野稻 48 度 O. 粒野稻 48 律宾 ,巴布亚新几内亚 O. 用野稻 24,48 亚洲热带、亚热带 ,澳大利亚热带 O. 点野稻 24 洲 O. 茎野稻 24 里兰卡 O. 洲野稻 48 洲 O. . 澳洲野稻 24 大利亚热带 O. . 短舌野稻 24 洲 O. 洲栽培稻 24 非 O. 颖野稻 24 丁美洲 O. 雄蕊野稻 24 4 洲 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 O. 方野稻 24 大 利亚热带 O. 年生野稻 24 洲热带、亚热带 O. 通野稻 24 洲热带、亚热带 ,澳大利亚热带 O. 洲栽培稻 24 世界 O. . ： *该种存在染色体数目为 48 的四倍体类型 . 8 in 生稻 在我国的地理分布 据现有资料确定，我国稻属植物共有 4 个种，其中 1 种为栽培稻，其余 3 种为野生稻，即 栽培 稻 （ .） 、普通野生稻（ 、药用野生稻（ 、疣粒野生稻（ 。中国三种野生稻分布十分广泛，据 1978 1982年 普查、考察结果，目前野生稻分布在广东、海南、广西、云南、江西、福建、湖南、台湾（现已绝迹）等 8 个省（自治区）的 143 个县（市），其中广东 53 个县（市）、广西 47 个县（市）、云南 19 个县、海南 18 个县（市、）湖南和台湾各 2 个县、江西和福建各 1 个县。 普通野生稻自然分布于广东、广西、海南、云南、江西、湖南、福建、台湾等 8 个省（自治区）的 113 个县（市），是我国野生稻种分布最广、面积最大、资源最丰富的一种，大致可分为 5个 自然区，即海南岛区、两广大陆区、云南区、湘赣区、台湾区，五区之间普通野生稻分布并不连续。药用野生稻分布于广东、海南、广西、云南四省（自治区）的 38 个县（市）。疣粒野生稻主要分布于海南、云南两省的 27 个县。台湾省在历史上曾发现有疣粒野生稻分布，目前情况不明 （应存山， 1993） 。 通野生稻的植物学特征 普通野生稻分布范围广，所处的生态环境复杂，不同类型形态特征各异，因此，普通野生稻具有如下植物学特征： （ 1）根：普通野生稻具有强大的须根系，除地下部长根外，地上部接近地面或水中的节也能长出不定根，在 原产地冬季能宿根并安全越冬。 （ 2）茎：根据生长习性可分为匍匐（茎倾斜超过 60以至完全匍匐于地面）、倾斜（茎倾斜30 60）、半直立（茎倾斜 15 30）和直立（茎倾斜不超过 15）四种类型。茎不具有明显的地下茎，有随水涨而伸长的特性，具有高位分枝，接近地面的茎节有须根。株高 60 300为 100 250杆粗细不一，直径一般 地上部有 6 12 个节，一般为 6 8 个节，近水面的茎节间较长，在深水条件下茎具有浮生特性；茎基部受阳光及其他原因影响，其颜色深浅不一，有紫色、淡 紫色、青绿色；分蘖力强，一般有 30 50 个蘖并集生为一丛。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 （ 3）叶：叶片狭长，披针状，一般 15 30 1耳呈黄绿或淡紫色，具有茸毛；叶耳膜质，顶尖二裂，无茸毛，有剑叶，叶舌长 1下部叶舌长 枕无色或紫色，基部叶鞘色为紫、淡紫或绿色，而以淡紫色居多；剑叶角度较大（ 90 135），剑叶较短，长 12 25 三叶较长（ 30 50， 最长的可达 123成熟后期，茎叶衰老较迟且慢。 （ 4）穗：属圆锥花序，穗枝散生，穗颈较长 （ 6 20枝梗较少，一般无第二枝梗。着粒疏，每穗 20 60 粒，多的达 100 粒以上（多见于直立型且具有第二枝梗）。外颖顶端紫红色，开花时内外颖淡绿色，成熟时 呈 灰褐色或黑褐色。护颖 呈 披针状，顶端尖，一般长 药较长，为 5 7头紫色或无色，外露呈羽毛状。具有坚硬的红长芒（占 90以上），少量无芒。谷粒狭长，长 7 9 2 实率有高有低，育性有高不育或半不育，极易落粒，边成熟边落粒。种皮多呈红色、红褐色或虾肉色。 （ 5）繁殖方式：在自然条件下，大多数普通野生稻结 实率在 50左右，可进行有性繁殖。宿根越冬，再生性和分蘖性强，无性繁殖占优势，因此普通野生稻在原分布点，无性和有性繁殖并存，以无形繁殖为主。 通野生稻的生态学特性与生态环境特点 普通野生稻在我国的南方地区 分布广泛 ，这是由于普通野生稻具有如下生态特性： （ 1）普通野生稻是喜高温植物。我国南方 8 省（自治区）都有普通野生稻分布，特别是海南、广东、广西三个省（自治区）分布最多，海南省的乐东、三亚、陵水三县（市）年平均气温为 24 25 ，最低气温为 6 8 ，无霜期为 365 天，两广大陆区的年平均气温也是在 20 以上。 （ 2）普通野生稻是喜光、感光性强、短日照的植物。各地发现的普通野生稻都生长在阳光充足、无遮蔽的地方，对光敏感，感光性强。无论种子萌发或宿根的植株都要在 8 月下旬以后才能抽穗，抽穗期与所处的纬度有关。 （ 3）普通野生稻是喜温多年生植物。普通野生稻喜欢湿生，水生特性很强，对水的要求很严，大多数分布在山区、丘陵、平原的山塘、河流两岸、山涧、水沟、河滩、排水渠道、水库、沼泽地、荒田等地，这些地方夏秋有浅水层，冬季土壤湿润，适宜普通野生稻的生长繁殖。 （ 4）普通野生稻对土壤有广谱的适应性。普通野生稻对土质 要求不严，一般生长在微酸（ 7）的土壤中，但它具有广泛的适应性，既能在酸性土壤上生长，又能在碱性土壤上生长，在重土、壤土、沙壤土、烂泥田、鸭屎土中也能生长。在肥沃的土中生长很茂盛，在极为瘦瘠的粘土中也能生长繁殖，只是生长不太茂盛。 （ 5）凡是适应浅水层生长的沼泽植物都能和普通野生稻混生。据考察，广东、广西普通野生稻的伴生植物有 25 种之多，主要有李氏禾（ 沙草 （ .） 、柳叶箬 （ 、水禾 （ 、水蓼 （ .） 、水马蹄 （ 、碎米沙草 （ .） 、金鱼藻 （ .）等。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 传多样性研究进展 遗传多样性本质上是遗传物质 核酸（ 组成上或结构上的变异。生物体中的遗传信息是从核酸（ 递 到 到蛋白质的流向而流动的。遗传物质的变异导致细胞结构、组织、器官的差异，进而导致个体乃至群体的 差异。因此，遗传多样性的表现形式呈现为多层次的。在分子水平，可表现为核酸、蛋白质、多糖等生物大分子的多样性；在细胞水平可体现在染色体结构的多样性以及细胞结构与功能的多样性；在个体水平，可表现为生理代谢差异、形态差异以及习性的差异 （陈灵芝， 2001） 。 因此 ，对于遗传多样性的研究可以从多个层次水平入手。 传多样性的研究方法 传统的遗传多样性研究方法主要是依靠表 型 性状遗传标记来探讨遗传多样性。利用表型性状来研究遗传多样性的主要缺点是可供分析的基因位点太少，不能客观全面 地反映 遗传变异信息（王和勇等， 2000） 。而且 表型性状 的遗传标记会受到生物发育阶段、环境条件等影响。 20 世纪 50 年代出现的蛋白质电泳技术以及以其为基础的同工酶、等位酶分析方法使遗传多样性研究 有了新的发展 。 报道了乳酸脱氢酶在不同组织不同个体以及不同种里的不同形式的存在，这就导致了 “ 同工酶（ ” 概念的产生：有机体常常产生酶的多种形式，即催化同一反应的不同分子形式 （王中仁， 1994） 。 在 1969 年提出把同一基因位点的不同等位基因所编码的不同形式叫做 “