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密级 : 论文编号 : 中国农业科学院 学位论文 石油烃厌氧生物降解过程中 的 产甲烷古菌研究 on on I 摘 要 本文主要以胜利油田罗 801 区块的油井采出水为例 , 研究石油烃厌氧降解产甲烷过程中关键的功能微生物类群 产甲烷古菌。研究成果如下 : ( 1) 分离纯化 8 株氢营养型产甲烷古菌(编号 : 一株甲 基营养型产甲烷古菌( 16S 列系统发育学分析发现菌株 海沼甲烷球菌 ( 相似性最高( 100%);菌株 短小甲烷卵圆形菌( 似性最高( 99%);菌株 3, 6 之间的相似性都在 99%以上,它们与棕榈油甲烷袋 状 菌( 相似性最高( ;菌株 竹节状 甲烷鬃毛菌( 相似性最高 ( 。以 亚基作为研究产甲烷古菌 系统进化的分子指标发现菌株 嗜热甲烷鬃毛菌( 相似性最高( 。 ( 2) 菌株 是目前 已知 的生长温度最高( 70 )的甲基营养型产甲烷古菌,依据菌株 生理生化和分子 生物学 特征把它 命 名为胜利甲烷嗜热微球菌新属新种( 。 ( 3) 以油井采出水为接种物富集培养 , 获得了稳定的氢营养型和 甲基营养型产甲烷古菌富集培养物,没有获得稳定的乙酸营养型产甲烷古菌富集培养物。以原油为唯一碳源富集培养, 55 富集培养半年后有甲烷产生,产生的甲烷碳同位素值接近传统观点认为的生物成因甲烷;原油饱和烃色谱图 中有 明显的 “ 凸起 ” ,正构烷烃含量逐渐减少,不知名化合物峰升高,少数甚至超过正构烷烃的峰高;与好氧生物降解不同的是,长链正构烷烃先于短链的被降解;同样被厌氧微生物作用的原油,不同重复之间 “ 凸起 ” 现象不一致,表明即使在相同的降解时间内,厌氧微生物降解原油的效果也是存在差异的。 关键词 : 石油烃 , 产甲烷古菌 , 厌氧烃 降解 , 甲烷 in of (1) 6S 00%),9%), , to 9% to by of of (2) on on of a is (3) by 5 as a as 3of to of of of of of of of 文缩略表 文缩写 英文全称 中文名称 球状菌属 烁古球菌 热铁还原细菌 硫状菌属 盐脱硫肠状菌属 硫弧菌属 壁菌门 酸盐加西亚菌 肪芽孢杆菌属 厌氧菌属 水海杆菌 烷杆菌属 烷杆菌目 烷杆菌科 氏甲烷杆菌 万诺夫甲烷杆 菌 热嗜碱甲烷杆菌 自养甲烷杆菌 烷短杆菌属 盐甲烷卵圆形菌 小甲烷卵圆形菌 烷球菌目 基甲烷 拟球菌 烷球菌属 沼甲烷球菌 自养甲烷球菌 榈油甲烷袋装菌 水甲烷嗜盐菌 兰甲烷嗜甲基菌 油甲 烷盘菌属 节状甲烷鬃毛菌 氏八叠球菌 式甲烷八叠球菌 烷球形菌属 肠甲烷球形菌属 氏甲烷球形菌属 烷嗜热杆菌属 利甲烷嗜热微球菌 化螺旋菌 硫单石菌 珀酸石杆菌 油神袍菌 形菌门 败希瓦氏菌 热厌氧杆菌 热厌氧杆菌属 球菌目 球菌属 温套管菌属 袍菌目 代微球形菌 / 没有记录或鉴定 苄青霉素 示原油及石油产品密度 制性扩增多态性分析 霉素 对照 碳优势指数 d 数 变性梯度凝胶电泳 甲基硫 125g/ 红霉素 ( 125g/ 500g/ 红霉素 ( 500g/ in 荧光原位杂交 hr 小时 in 位 TS 内转录间隔区 那霉素 甲烷富集培养物 微生物采油技术 -( -( 乙烷磺酸 分钟 V 胺 s 毫帕 秒(动力粘度单位) MT 基甲烷 ot 没有记录或鉴定 酸盐还原菌 偶优势 对氨基苯甲酸 聚合酶链式反应 嗪 - 1,4福平 数每秒(转速单位) 酸盐还原菌 单链构像多态性 酸链霉素 温度梯度凝胶电泳 甲胺 末 端 限制性片断长度多态性 录 第一章 绪论 . 1 究背景 . 1 究目 的和意义 . 1 油烃厌氧生物降解过程中产甲烷古菌的功能和作用 . 1 油烃厌氧生物降解产甲烷的生物模拟实验 . 2 内外研究现状 . 2 言 . 2 藏中不同生理类群的厌氧微生物研究进展 . 3 藏 微生物分子生态学研究进展 . 6 氧石油烃生物降解的研究进展 . 8 第二章 产甲烷古菌的分离、纯化和菌株 鉴定 . 10 品采集地的油藏地质特征 . 10 验技术和方法 . 11 品采集 . 11 品中产甲烷 古菌的富集培养 . 12 离纯化 . 13 度鉴定 . 15 态学研究 . 15 理生化鉴定 . 16 因组 G+C 摩尔含量的测定 . 18 6S 列和 因序列的扩增、测序与系统发 育学研究 . 19 验结果 . 20 集纯化 . 20 株 形态学特征 . 21 株 生理生化特征 . 24 株 基因组 G+C 摩尔百分含量 . 31 株 系统发育学分析 结果 . 32 论 . 36 基营养型产甲烷古菌的分类学研究 . 36 基营养型产甲烷古菌的生态学功能 研究 . 40 为产甲烷古菌系统发育学研究的分子指标 . 40 第三章 石油烃厌氧富集产甲烷初步模拟试验 . 41 验目的 . 41 验材料和方法 . 41 品来源 . 41 术和方法 . 41 果 . 43 同营养类型产甲烷古菌的富集培养 . 43 油烃在厌氧条件下的降解及产甲烷能力 . 43 论 . 46 酸营养型产甲烷古菌在油藏中的分布 . 46 油烃降解产甲烷初步模拟试验 . 46 第四章 全文结论、工作不足与展望 . 49 文结论 . 49 藏中产甲烷古菌的富集与分离纯化 . 49 株 生理生化特征研究及系统发育学分析 . 49 油降解产甲烷模拟试验 . 50 作不足与展望 . 50 有获得乙酸营养型产甲烷古菌纯培养物和富集培养物 . 50 有获得厌氧烃降解菌的纯培养物 . 50 有研究油藏中甲基营养型 产甲烷古菌的生态学功能 . 50 参考文献 . 52 致 谢 . 68 附 录 . 61 作者简历 . 70 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 究背景 我国目前面临着能源短缺与大量已有石油资源进一步有效开发的突出问题。据预测,采用现有的开采技术,到 2010 2020 年,我国石油缺口将达到 吨,进口依存度达 47% 60%( 中国投资资讯网 2006) ;而另一方面,我国低品位油气资源储量巨大 ( 主要是低渗透油田、特/超稠油油田和高含水、高采出程度的老油田 ) 。其中,高含水、高采出程度的老油田储量占的比例越来越大,目前已有 35 亿吨的储量含水超过 95%,预计 10 年后含水超过 95%的储量将达到70 亿吨以上。经过化学驱等三次采油以后,其平均采收率仅为 1/3 左右,并且经过长期注水开发甚至三次采油的油藏,其开发效果和效益越来越低,这类油藏依靠现有的改变驱替相性质提高采收率的技术方法已很难奏效。因此,如何最大限度地开发低品位油藏资源已成为世界各石油生产国共同关注的热点问题。为此,国内外均有学者提出通过微生物菌群在厌氧条件下生物降解油藏的残余油并转化为甲烷进行气态烷烃开采的 思路,这种类似于农村户用沼气发酵池的原位残油降解产甲烷的油藏被称为 “ 地质生物反应器( ” ( et 000, et 005, et 999, 承磊 et 006) 。 将低品位油藏转化为气藏进行深度开采,从而大幅度提高低品位油藏的利用程度的 油藏变气藏 技术也是微生物采油技术的突破和延伸 。 究目的和意义 油烃厌氧生物降解过程中产甲烷古菌的功能和作用 产甲烷古菌是一类极端厌氧古菌,通 常和其他细 菌形成一种特殊的互营关系,持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷 , 处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌在生物圈碳元素循环中起着重要作用 ( 003, 戚厚发 et 997) 。产甲烷古菌广泛分布 在 淡水海水沉积物、地热环境、土壤、动物肠胃及瘤胃、厌氧污泥消化器和中国传统发酵酿酒窑池等厌氧生境中 ( 农业部厌氧微生物重点开放实验室 1997) 。在油藏这种独特的地质环境中,国外学者报道过油藏产甲烷古菌的分离、鉴定 ( et 000) ,而国内在这方面的研究还比较少。 在石油烃厌氧降解过 程中,产甲烷古菌利用产乙酸菌降解原油产生的一碳化合物作为底物生长产生甲烷,同时也解除了乙酸和 学者在实验室水平研究并认为产乙酸菌首先厌氧降解十六烷产 生 乙酸和 氢营养型和乙酸营养型产甲烷古菌从两条途径利用乙酸和 见图 1) ( 999, 999) ,但是在油藏环境中产甲烷古菌的营养类型及其分布仍不太清楚,特别是乙酸营养型产甲烷古菌在油藏是否存在仍然有很大的分歧和争论 。因此需要进一步研究不同营养类型产甲烷古菌在油藏中的分布情况。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 2 图 1. 厌氧降解十六烷产甲烷 代谢 途径 by 石油 烃 厌氧生物降解产甲烷的生物模拟 实验 虽然已经通过实验证明了厌氧烃降解的存在,并在受原油污染的地下水域发现并证明了厌氧烃生物降解过程,但是人们对烃厌氧降解产甲烷的微生物群落结构以及厌氧烃降解的代谢机理了解甚微 ( et 005, et 004, et 003, 999) ,迄今为止 也 没有从油藏中分离鉴定厌氧烃降解菌的报道。地质学家们发现在稠油油田附近或周围常常伴有大规模的可以聚集成藏的稠油降解气 ( 朱光有 et 006) ,而且通过检测厌氧烃代谢产生的生物标记物及甲烷碳氢同位素等方法发现无论是海相还是陆相成因的油藏中都存在有厌氧烃降解过程( et 004) 。这说明厌氧烃降解菌的确存在于油藏中,并且厌氧烃降解产生的甲烷可以很好的被圈盖聚集成气藏,因此实验室模拟石油烃厌氧降解产甲烷实验并结合有机地球化学系统分析厌氧降解原 油过程中原油组分变化、原油产甲烷潜量、产生的甲烷和二氧化碳的碳同位素分布就显得尤为重要 。 内外研究现状 言 油藏通常由沙石、石灰石或白云石的沉积物组成,油岩中的空隙、裂缝和断裂带中充满了油、气和水。不同油藏的地质条件(沉积环境、源岩和原油成熟度)及理化特征(如温度、 浓度、压力等)差异很大 ( et 003, et 000) 。世界上大部分油藏中的油气是可以生物降解的,虽然人们推测油藏中存在有本源微生物,但是迄今为止还没有直接的微生物学 证中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 3 据表明地下深层油藏中有微生物的存在 ( 004, et 003) 。油藏经注水开采后,大量微生物可能随注水进入油藏生存下来,并且改变油藏的地质化学环境 ( 003) 。尽管采用注水开采原油,但是氧不大可能直接随水流入地下深层油藏,因此地下油藏主要是缺氧环境( 000) 。 早在上世纪 20 年代就发现了油井采出水中微生物的存在,但由于技术的约束而无法进一步开展油藏中厌氧微生物学研究。以 氧操作技术为基础的厌氧可培养技术应用于油藏微生物学研究后,人们 认识到了油藏中厌氧微生物的多样性,其生理类群主要可以分为发酵菌、硝酸盐还原菌、铁还原菌、硫酸盐还原菌和产甲烷古菌。尽管有人 从油井采出水中也分离到了降解石油烃的好氧微生物 ( et 003) ,但在油藏这种特殊环境中,好氧微生物难以正常生长繁殖。所以,能够在油藏中生长代谢的微生物,只能是以 硝酸盐、硫酸盐、三价铁、二氧化碳和有机酸等作为电子受体营厌氧呼吸或发酵的 厌氧菌。 藏中不同生 理类群 的 厌氧微生物研究进展 1) . 发酵菌 ( : 发酵菌是一类能发酵 糖、氨基酸、长链有机酸等复杂有机物产 酸等短链有机酸的细菌和古菌的总称,大部分发酵菌可以还原亚硫酸盐或硫产 000) 。发酵菌特别是嗜热发酵菌在地下油藏中分布广泛,不同的油藏条件分离出不同种属的发酵菌,但随着油藏温度升高,可分离出的菌株多样性随之降低。从各种油藏中分离的发酵菌主要分布于热袍菌目( 热球菌属( 嗜热厌氧杆菌属( 盐厌氧菌属 ( 中。 热袍菌目细菌是 一群独特的极端嗜热微生物,具有特征性的鞘状结构( 16S 列分析表明其在进化树上是非常古老、进化缓慢的一个分支。热袍菌目中的石油神袍菌属( 菌全部分离自油井采出水 ( et 004) 。热球菌属菌都是嗜热古菌,主要分布在高温油藏中 ( et 000, et 993, 000) ,生长温度 8090 C,还原硫产生 酵产物为乙酸、丙酸和丁酸等短链有机酸,这也避免了产 来的反馈抑制作用。从油藏分离的 嗜热厌氧杆菌以硫代硫酸盐作为电子受体,发酵葡萄糖产乙醇、 乙酸、 地下嗜热厌氧杆菌( 发酵葡萄糖还可以产种也存在于热袍菌目、热球菌属中的独特代谢特征被认为是远古细菌遗留下来的( et 000) 。 上述发酵菌都是嗜热和极端嗜热菌,而从油藏中分离的盐厌氧菌属则是中度嗜盐的嗜温菌,乙酸、 发酵葡萄糖的主要产物 ( et 999) 。 从油藏中分离的发酵菌还原硫代硫酸盐产 一反应在硫的地球生物化学循环过程中起着重要作用,同时为认识和防治油井设备的腐蚀提供了新的视角 ( et 995) 。虽然发酵菌在油藏中的生态功能人们还知之甚少,但发酵细菌产的 以为微生物生长提供电子供体,在地下油藏这种特殊的寡营养环境中或许起着重要的作用 ( et 007, et 005a, et 999) 。 2) . 硝酸盐还原菌( : 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 4 近年来从油藏分离到的硝酸盐还原菌大 都归为新属 ( et 000, et 005b, et 999, et 003, et 004) 。这也许暗示油藏中蕴藏着大量被忽略的硝酸盐还原菌,但只有硝酸盐加西亚菌 ( 和嗜硫单石菌( ( 005b, 003) 是专性厌氧菌, 它们 还原硝酸盐为氨 ,也可以发酵若干种糖类化合物和有机酸。其他都是兼性好氧菌,利用有机酸生长,如琥珀酸石杆菌( ( 004) 在氧或硝酸盐(被还原为 在条件下利用延胡索酸盐、丙酮酸盐、琥珀酸盐、甲酸、乙醇、酵母浸取液生长。硫代微球形菌( 两株菌 是微好氧菌, 菌株只能把硝酸盐还原为亚硝酸盐 ( 000) 。油水海杆菌( 盐、兼性好氧,好氧降解十六烷、姥鲛烷和石油中的部分组分,在厌氧条件下可还原硝酸盐降解部分糖和氨基酸 ( 999) 。 油藏中硫酸盐还原菌生长产生 油藏中注入硝酸盐和硝酸盐还原菌或激活内源的硝酸盐还原菌可以抑制硫酸盐还原菌的生长并可以生物转化已存在的 et 007, et 002, et 001a, et 001b) 。 3) . 铁还原菌( : 的氧化物和氢氧化物广泛存在于地下包括油藏中,它们的价态很容易发生改变( et 999) 。在厌氧生态环境,特别是高温厌氧环境中它们可作为铁还原菌的电子受体,并且这类微生物一般靠近进化树底部 ( et 998) 。 et 997)首次报道从油藏中分离鉴定了一株嗜热铁还原细菌( 可利用乙酸盐等有机酸和 、 和硝酸 盐作为电子受体。从油藏中分离的另一株腐败希瓦氏菌( 能以 999) 认为深层油藏中许多不同类型的嗜热和超嗜热厌氧菌都能够还原,并推测油藏中铁还原菌通过地热反应或发酵反应产生的 乙酸(发酵细菌降解复杂有机物的产物)作为碳源生长并且代谢途径多样化。 4) . 硫酸盐还原菌( : 硫酸盐还原菌是一类以硫酸盐为电子受 体、严格厌氧的细菌或古菌,能还原硫酸盐、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、元素硫为硫化氢。根据从油藏中分离到的硫酸盐还原菌的营养需求,硫酸盐还原菌可利用多种不同电子供体 ( et 996, et 994) : ( 1)由地质变化、金属腐蚀和在采油过程中形成的 2)油藏形成早期和原位高温水解产生的脂肪酸;( 3)好氧细菌在利用石油烃生长的过程中形成的极性有机副产物;( 4)石油烃。 et 000)根据分子系统发育学( 16S 硫酸盐还 原菌分成四类 : G 嗜温菌、 G+产芽孢硫酸盐还原菌、嗜热硫酸盐还原细菌和嗜热硫酸盐还原古菌。从油藏中分离到 G 嗜温菌多属于脱硫弧菌属( ( et 004) ;嗜盐脱硫肠状菌属( 内生芽胞,中度嗜盐(最适生长盐浓度 46%),还原硫酸盐、亚硫酸盐和硫代硫酸盐产生 还原硫、延胡索酸盐和硝酸盐 ( et 998) ;从油藏发现的两株 脱硫状菌属细中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 5 菌 ( 适 生长温度都是 60C,均可以化能异养和化能自养生长( ; 嗜热硫酸盐还原古菌主要分布在古球状菌属( ( et 999) 。 et 994) 首次从油田水中分离到了闪烁古球状菌( 最适生长温度 76C,以硫酸盐作为电子受体,以 用乳酸盐、丙酸盐、戊酸盐生长。 993) 也从油藏中发现了类似于古球状菌的硫酸盐还原菌,在 85推测在地下深层油藏可能存在超嗜热古菌。 油井采出水通常含有乙酸、丙酸、丁酸等短链有机酸以及地热反应或发酵细菌降解产生的 为硫酸盐还原菌生长提供了营养物质。在不同的矿化度和温度下都可生长繁殖的硫酸盐还原菌产生的 金属离子形成沉淀抑制油水分离 ( 000) ,对采用化合驱的油田来说,它使聚丙烯酰胺黏度下降而导致化学驱失效。 5) . 产甲烷古菌( : 产甲烷古菌是一类极端厌氧古菌,广 泛分布于淡水海水沉积物、地热环境、土壤、动物肠胃及瘤胃、厌氧污泥消化器和中国传统发酵酿酒窑池等厌氧生境中 ( 农业部厌氧微生物重点开放实验室 1997) 。产甲烷古菌和其他细菌形成一种特殊的互营关系持续降解生物质并接受末端电子产生甲烷,处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌在生物圈碳元素循环中起着重要作用 ( 003, 戚厚发 et 997) 。 早在 1983年就 有 从油藏中分离出产甲烷古菌的报道。近年来从油藏分离若干株新的产甲烷古菌 见 表 1,按营养类型可分为( 1)氢营养型 : 氧化 包 括能氧化甲酸的产甲烷古菌。已报道的 7株嗜温和嗜热氢营养型产甲烷古菌轻度或中度嗜盐,如耐盐甲烷卵圆形菌( 在 012%2545 et 998) ,热自养甲烷球菌( 1762适生长温度 60C( et 996) 。 ( 2) 甲基营养型 : 利用甲基化合物(甲醇、甲胺、二甲基硫化 物)作为底物生长,嗜盐甲烷嗜盐菌属( 适生长条件是37C、 物素、钙镁离子是生长的必需因子 ( et 997) 。斯氏甲烷八叠球菌( 也是轻度嗜盐 古 菌,利用甲醇、甲胺和二甲基硫 作为底物生长 。 ( 3) 乙酸营养型 : 利用乙酸产甲烷。到目前为止也只有一株马氏八叠球菌( 离自油田水。许多学者观察到乙酸营养型产甲烷古菌在富集培养物中存在,但 尝试分离乙酸营养型产甲烷古菌都没有成功,因此推测油藏中只存在有氢营养型和甲基营养型产甲烷古菌( 005a, 996, 998) ,然而 盐未注水油藏中 ( 005a) 。 中国农业科学院 硕 士学位论文 第一章 绪论 6 表 属 最适度 (%) 生长温度 /最适生长温度 ( ) 生长底物 引用文献 氢营养型: 伊万诺夫甲烷杆菌 055/ 45 983) 热自养甲烷杆菌 2070/ 60 983) 布氏甲烷杆菌 02 2540/37 993) 嗜热嗜碱甲烷杆菌 02 3080/65 993) 热自养甲烷球菌 762/60 996) 石油甲烷盘菌属 13 2843/37 997) 耐盐甲烷卵圆形菌 5 2545/38 998) 甲基营养型: 盐水甲烷嗜盐菌 6 1050/2837 987a, 997) 斯氏甲烷八叠球菌 1050/37 991, 994) 乙酸营养型: 马氏八叠球菌 1050/37 987b) 处于厌氧生物链最末端的产甲烷古菌新陈代谢可以解除生物链的末端抑制,使得一系列的生化反应持续不断的进行 ( 戚厚发 1997) 。对微生物采油而言,油藏中产甲烷古菌的生长繁殖可以促使发酵菌等微生物更好的生长繁殖,其代谢活动可改变油层中的微环境(微生物调剖、产酸产气)从而提高采油率。 1999年和 2005年国外分别报道了产甲烷富集培养物降解长链烷烃产甲烷,以及受石油烃污染的地下蓄水层烃的厌氧生物降 降 产甲烷作用 ( et 005, 999) 。为此,有专家针对某些油田的开采难度提出了把油藏中残留的石油烃

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