细胞培养及材料细胞毒性检测PPT课件

细胞培养cellculture 前言细胞培养的基本概念细胞培养的基本条件细胞培养的基本方法细胞培养的污染和检测细胞冻存和复苏细胞管理及保藏细胞毒性检测 主要内容 WilhelmRoux 1850 1924 1885年Roux最早尝试使组织离体培养 材料是鸡胚神经板 采用生理盐水为培养液 并首次采用组织培养这个术语 1 前言 AlexisCarrelFranceRockefellerInstituteforMedicalResearchNewYork NY USAb 1873d 1944 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法 用于研究离体动物细胞的培养 他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了34年之久 1912 1946 器官培养 Organculture 将活体中整个器官或一部分器官取出 置于体外生存 生长并同时保持其一定的结构和功能特征 组织培养 Tissueculture 把活体的一小片组织 O 5 1立方毫米 置于底物上孵育 细胞自其周围移出并生长 细胞培养 cellculture 把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液 后进行培养 增殖 2 基本概念 肿瘤 胚胎 成体 粗切 消化 细切 修切 细胞培养 组织培养 器官培养 细胞培养的优点 活细胞便于观察检测条件可控均一性便于人工筛选 培养细胞与体内细胞的差异 失去原有组织结构和形态 趋向单一性分化减弱可能获得不死性 体外培养细胞的生长类型 贴壁型 动物的正常细胞悬浮型 血液淋巴细胞 肿瘤细胞 植物细胞固定化培养 来源 由中胚层间充质组织起源的组织如 真正的成纤维细胞心肌 平滑肌 成骨细胞 内皮细胞形态 似体内成纤维细胞的形态胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2 3个长短不等的突起中有卵圆形核 成纤维细胞样细胞 生长特点 排列成放射状 漩涡状并不紧靠连成片 细胞 细胞接触易断开而单独行动 培养细胞的生长和增殖过程 原代细胞 从机体取出后立即培养的细胞原代培养 将从体内取出的细胞进行培养传代培养 从原代培养细胞继续转接培养传代细胞 在体外培养条件下持续传代培养的细胞 细胞培养的工作原则 无菌无毒 生物相容性清洁的环境品质良好的细胞来源 培养基配制使用高纯度药品和去离子水有标准化的工作方法培养用的液体极多 应由专人负责 配制浓度准确 所有配好的溶液瓶上都要标明名称 浓度 消毒与否和制备日期等一切培养用品都要有固定的存放点 避免杂乱无章 其中尤其重要的是 培养用品与非培养用品应严格分开 已消毒品与未消毒品应分别存放 3 细胞培养的基本条件 无菌条件 净化工作室 风淋室 传递窗 高效过滤器 洁净层流罩 生物安全柜 超净工作台 紫外灯 电热干燥箱 滤器 高压灭菌器 抗生素细胞生长条件 培养板 培养瓶 CO2培养箱 培养基 血清细胞检测条件 倒置显微镜 酶标仪 微孔板震荡器 高速离心机 移液器细胞保存条件 液氮罐 超低温冰箱 常用仪器与设备 超净工作台高压蒸汽灭菌器过滤除菌装置倒置显微镜水纯化装置恒温培养箱电热干燥箱离心机 天平 水浴 摇床液氮罐冰箱 4 20 80 细胞培养器材 移液器移液管吸管培养瓶 25cm2 75cm2 150cm2培养皿 30 60 120毫米多孔培养板 4 6 24 96孔离心管冻存管 基础培养基80 95 血清5 20 青 链霉素各100U ml 完全培养基的组成 天然培养基 血清血浆组织提取液 如鸡胚和牛胚浸液 培养基 合成培养基 根据细胞生存所需物质的种类和数量 用人工方法模拟合成的 包括四大类物质 无机盐 氨基酸 维生素 碳水化合物目前常用培养基 RPMI 1640 DMEM M199 MEM 人工合成培养基只能维持细胞生存 要想使细胞生长和繁殖 还需补充一定量的天然培养基 如血清 常用血清胎牛血清 新生牛血清 小牛血清 兔血清 马血清等优质血清的标准透明 淡黄色 无沉淀物 无细菌 支原体 病毒污染 血清的灭活 消除补体活性 56 30分钟 血清的消毒 过滤除菌 血清的使用 其他细胞培养用液 水 新鲜的三蒸水或去离子水平衡盐溶液主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用 维持渗透压 缓冲和调节酸碱度常用的缓冲液 生理盐水PBSHanks液 D Hank s常用于配制胰酶溶液 抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用 俗称 双抗溶液 配制具体操作均在超净台内完成 青霉素是80万U 瓶 用注射器加4ml灭菌双蒸水 链霉素是100万U 瓶 加5ml灭菌双蒸水 即每毫升各为20万U 使用时溶入培养液中 使青 链霉素的浓度最终为100U ml 庆大霉素 使用终浓度为100U ml 广谱 稳定 主要作用 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键 除去细胞间粘蛋白及糖蛋白 使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离 常用浓度 0 25 用无Ca2 Mg2 的PBS缓冲液或D Hank s配制 用滤器过滤除菌 消化时间 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 胰蛋白酶溶液 消化液 胰蛋白酶溶液 EDTA溶液 胶原酶溶液 贴附生长型细胞必须贴附于底物才能生长的细胞 从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型 还有一些难以确定其稳定形态的细胞 4 细胞培养的基本方法 粘着 粘附 attachment 铺展 spreading 得到细胞 1 取材 切割 组织块培养法 消化培养法 2 直接购买 培养 原代培养 传代 体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代 以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞 并维持细胞种的延续 培养的细胞形成单层汇合以后 由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭 将培养的细胞分散 从容器中取出 以1 2或l 3以上的比率转移到另外的容器中进行培养 即为传代培养 弃去旧培养液 清洗 加入消化液 吸弃消化液 加入培养液 吹打分散细胞 分装稀释细胞 补加培养液 继续培养 接种数量为5 104 8 105个 ml 传代密度太低 细胞容易死亡 表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期 培养液由于pH下降而呈现黄色 表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养 如果是单层贴壁的细胞 等长满培养瓶表面 即可进行传代 传代注意事项 游离期悬浮 胞质回缩 全部细胞变为圆球形 吸附期贴附底物 一般24小时内贴壁 潜伏期此时细胞有生长活动 基本无增殖 细胞株潜伏期一般为6 24小时 对数生长期细胞数随时间变化成倍增长 活力最佳 最适合进行实验研究 停止期 平台期 细胞长满瓶壁后 细胞虽有活力但不再分裂 机制 接触抑制 密度依赖性 细胞传代的增殖生长过程 细胞观察 肉眼观察 培养液的颜色和透明度显微镜观察生长良好的细胞 细胞透明度大 折光性强 轮廓不清生长状态不良的细胞 细胞轮廓增强 细胞折光性变弱 胞质中出现空泡 脂滴和其他颗粒状物质 细胞之间空隙增大 细胞形态不规则 甚至失去原有细胞的特点 产生圆缩脱落 有时细胞表面及周围出现丝絮状物 细胞计数 每毫升细胞数血细胞计数板 细胞生长的指标 细胞生长曲线贴壁率有丝分裂指数 MI 分裂相数量占全部细胞数量的百分比细胞群体倍增时间四唑盐 MTT 比色法标记胸腺嘧啶脱氧核苷 3H TdR 掺入量 细胞活力测定 细胞活力 总细胞中活细胞所占的百分比台盼蓝法四唑盐 MTT 比色法荧光素双乙酸酯法 FDA 四唑盐 MTT 比色法MTT比色法的原理 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢 formazan 并沉淀在细胞中 而死细胞没有这种功能 二甲亚砜 DMSO 能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物 溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比 甲臢染料在A570nm处产生吸收值 用酶标仪测定A值 细胞培养的其他指标 细胞大小 显微测微计法细胞重量 称重法鲜重干重 细胞固定与染色 细胞固定苏木精 伊红染色Giemsa染色Feulgen染色考马斯蓝染色免疫法细胞核染色 Hoechst DAPI 细胞污染 混浊 pH异常改变 细胞外形模糊 漂浮的集落细胞出现增殖缓慢或死亡化学物质的污染非同种细胞污染微生物污染 细菌 真菌 支原体 病毒 5 细胞培养的污染和检测 细菌污染 培养液变黄 出现浑浊镜下可见圆球状颗粒漂浮预防和处理 青霉素 链霉素 真菌污染 培养液一般不浑浊白色或黄色小点漂浮于培养基表面光镜观察到菌丝预防和处理 抗真菌剂 支原体污染 可透过滤膜无细胞壁 细胞营养液仍清亮但变黄 细胞生长变缓 部分细胞发生脱落 细胞间隙可见铺满细沙样小点 污染的控制 预防重新培养鉴别清除 抗生素 加温 支原体特异性血清 共培养法 重新克隆法 动物体内接种除菌法防止交叉污染 6 细胞冻存与复苏 慢冻快融低温保护剂 10 的甘油或二甲亚砜DMSO 细胞深低温保存的基本原理 80 以下时 细胞内的酶活性均己停止 即代谢处于完全停止状态 故可以长期保存 慢冻快融 当细胞冷到零度以下 可以产生以下变化 细胞器脱水 细胞中可溶性物质浓度升高 并在细胞内形成冰晶 如果缓慢冷冻 可使细胞逐步脱水 细胞内不致产生大的冰晶 相反 冰晶很大 大冰晶会造成细胞膜 细胞器的损伤和破裂 复苏过程应快融 目的是防止小冰晶形成大冰晶 即冰晶的重结晶 7 细胞的管理及保藏 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称 细胞的命名无严格统一规定 大多采用有一定意义缩写字母或代号表示 但不论什么形式 均不宜太长 以便记忆和了解 HeLa 为供体患者的姓名 HenriettaLacks 来源于宫颈癌 CHO 中国仓鼠卵巢细胞 ChineseHamsterOvary NIH 3T3 美国国立卫生研究所 NationalInstituteofHealth 建立 每3天传代一次 每次接种3 106细胞 毫升 细胞库的建立 主细胞库生产用细胞库 原始细胞库 主细胞库 生产细胞库 细胞保存机构 ATCC AmericanTypeCultureCollection ECACC EuropeanCollectionofCellCultures 中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库 8 细胞毒性检测 参照GB T16886 5 2003 或ISO10993 5 医疗器械生物学评价 第5部分 细胞毒性试验体外法规定的方法进行检测 样品准备 辐照灭菌将待检材料在相应条件下浸提 不含血清的培养基中在37 环境下浸提24h 细胞计数接种于96孔培养板 置CO2培养箱37 培养24h后 弃去原培养液 空白对照组加入新鲜细胞培养液 供试品加入样品浸提液 加血清 置CO2培养箱继续培养 至少24h 于设定培养时间后置显微镜下观察细胞形态 每孔加入20 L质量浓度为5g L的MTT溶液 继续培养4h后弃去孔内液体 加入200 LDMSO 在酶标仪570nm波长下测定吸光度