【毕业学位论文】（Word原稿）油菜脂肪酸合成关键基因的克隆与脂肪酸积累模式研究生物化学与分子生物学硕士论文

密级： 论文编号： 中国农业科学院 硕士学位论文 油菜 脂肪酸合成关键基因的克隆 与 脂肪酸积累模式研究 I 摘 要 随着拟南芥和水稻等模式植物全基因组测序的完成，油料作物的遗传改良也迎来了前所未有的大好机遇。根据模式生物的基因序列信息克隆与农业生产相关的关键基因，对它们进行深入的 功能结构分析，并将研究成果应用于分子育种和作物改良是当前摆在育种工作者面前刻不容缓的任务。本研究的目的是克隆油菜中控制脂肪酸组成和含油量调控的关键基因，深入分析这些基因的序列特征与功能关系，研究种子发育过程中脂肪酸的合成模式，搭建植物脂肪酸基因调控的转化平台，为油菜脂肪酸组成和含油量的分子育种工作奠定基础。 在油菜脂肪酸合成关键基因的 分离 与序列特征分析的研究中 ， 作者分别从油菜基因组中分离得到脂肪酸延长酶基因（ 脂肪酸去饱和基因（ 生物素羧基载体蛋白基因（ 然后利用 软件对分离到的基因及其编码蛋白进行序列 比对分析 。对于 因，实验中共得到 4 条不同的拷贝，其编码区均无内含子，分别来自中油 821 与中双 9 号的 A、 C 基因组。其中来自中油 821 的拷贝序列长度均为 1521码 506自中双 9 号的序列长度为 1517码 466于 因，实验中获得 4 条具有完整开放阅读框的拷贝，其编码区内均无内含子，长度均为 1152编码 384于 因，根据结构特点可将得到的序列分成 3 种类型，它们均包含 5 个内含子。其中 1464码 277唯一具备完整生物素化功能结构域的拷贝； 长度分别为 1465 1660别编码 193 194编码蛋白合成提前终止。深入分析后发现导致 码蛋白长度缩短的根源在于其内含子 3 与 4 之间存在一个由碱基 研究为利用上述基因开展基因工程和分子标记育种提供了科学依据。 在油菜种子发育过程中主要脂肪酸积累模式的研究中，作者比较 了高 芥酸中油 821 与低芥酸 中双 9 号 油菜种子发育过程中 7 种 主要脂肪酸的 合成 代谢 模式 ， 并 对数据进行了相关性分析及主成分分析。 研究表明，饱和脂肪酸（ ,）和多不饱和脂肪酸 （ ,）的脂肪酸累积模式在中油 821 与中双 9 号中非常相似，均呈 “ 升 平 ” 模式，合成主要集中在授粉后前 15 天 。油酸 （ ） 合成呈 “ 升 降 ” 模式，但在中双 9 号中积累时间明显延长，积累量显著增大。二十碳烯酸（ ）与芥酸 （ ） 的合成分别呈现 “ 不均等波浪 ”和 “二段” 模式，合成基本始于授粉后第 15 天，但在中双 9 号中合成 基本中断。 与中油 821相比，中双 9 号种子发育过程中各主要脂 肪酸的相关关系发生显著变化，根据主成分分析可以聚为 3 类，第一类为饱和脂肪酸，第二类为油酸，第三类为多不饱和脂肪酸。同类脂肪酸的 积累模式 十分 相似，第一与第三类脂肪酸相互制约 、此消彼长， 呈现一定的负相关关系。 本实验还构建了拟南芥、烟草和油菜的遗传转化平台，并在拟南芥中对 统进行了功能验证。为进一步研究脂肪酸合成过程，将研究成果应用于生产实践搭建了下游平台。 关键词 ：油菜；基因克隆；脂肪酸积累模式； 点特异性重组系统； 遗传 转化平台 NA of in of of in of to In to of is to in of to to of to In of NA of of in NA 4 21 21 521in 06o.9 517in 66No in 4 RF It 152in a 384aa no in 3 of of is a is by an in of In of of of 21 by of ,) ,) of 5 ) a in o.9 in 21. ) ) 5in ,) as o.9 o.9 to of 21. to o.9 be as as in of no if re/It in of to of 录 引言 . 1 第一章 文献 综 述 . 2 油菜主要脂肪酸及其合成关键基因的研究进展 . 2 超长链脂肪酸与 因的研究进展 . 2 不饱和脂肪酸与 因的研究进展 . 7 饱和脂肪酸与 因的研究进展 . 13 油菜中主要脂肪酸的遗传与调控规律研究现状 . 18 位点特异性重组系统与高安全性载体构建 . 19 位点特异性重组系统的种类 . 19 统的重组原理 . 19 统存在的问题和解决办法 . 20 利用 统进行植物基因操作的操作原理 . 21 位点特异性重组系统在植物研究领域中的应用 . 21 利用位点特异性重组系统进行植物基因操作的研究历史与现状 . 22 农杆菌介导的植物遗传转化 . 23 油菜 . 24 烟草 . 36 拟南芥 . 37 第二章 油菜脂肪酸合成关键基因的分离与序列特征分 析 . 44 材料与方法 . 44 材料 . 44 方法 . 44 结果 . 50 因的分离 . 50 因的分离 . 57 因的分离 . 63 讨论 . 68 所分离基因及其编码蛋白的比对分析与讨论 . 68 两种克隆方法的比较 . 76 第三章 油菜种子发育过程中脂肪酸积累模式研究 . 78 材料与方法 . 78 材料 . 78 播种方法 . 78 试 验设计和取样方法 . 79 脂肪酸分析方法 . 79 数据处理与分析方法 . 80 结果 . 80 脂肪酸与出峰时间对应关系的摸索结果 . 80 种子发育过程中脂肪酸含量的半粒法测定结果 . 81 讨论 . 83 主要脂肪酸的积累模式 . 84 脂肪酸积累模式受高低芥酸品种不同的影响 . 86 V 各脂肪酸积累模式之间的相关性 . 87 脂肪酸合成模式的基因调控 . 90 油菜脂肪酸的整体合成模式 . 92 油菜中硫甙总量与主要脂肪酸积累模式之间的 关系 . 93 第四章 植物遗传转化平台的构建与 统的功能验证 . 95 拟南芥转化平台的构建及 统的功能验证 . 95 材料 . 95 方法 . 97 结果 . 98 烟草与油菜转化平台的构建 . 110 烟草 . 110 油菜 . 114 第五章 总结 . 122 脂肪酸合成关键基因的分离与研究 . 122 种子脂肪酸累积模式研究 . 123 遗传转化平台的构建 . 125 参考文献 . 126 致谢 . 141 个人简介 . 142 图及附表清单 图 1肪酸合成每个循环的 4 步反应 . . 1 N 端跨膜结构域模型 . 1中部跨膜结构域模型 . 1拓扑学结构示意图 . 1催化过程示意图 . 1基的空间结构 . 1基的准双轴对称图 . 1基的锤头结构对称图 . 1基的疏水核心 . 2-1 因扩增产物电泳图 . 2-2 因筛选电泳图 . 2-3 因扩增产物电泳图 . 2-4 因筛选电泳图 . 2-5 因扩增产物电泳图 . 2-6 因筛选电泳图 . 2法一所用克隆载体结构图 . 3粒法测定中油 821 和中双 9 号油菜种子中脂肪酸含量的标准气相色谱图 . 3油 821 开花后第 20 天至 45 天每隔 5 天脂肪酸组成半粒法气相色谱测定图 . 3双 9 号开花后第 20 天至 45 天每隔 5 天脂肪酸组成半粒法气相色谱测定图 . 3种脂肪酸的转化关系 . 3榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸的百分含量在种子发育过程中的变化趋势图 . 3酸、二十碳烯酸、芥酸的百分含量在种子发育过程中的变化趋势图 . 3肪酸合成全过程主要脂肪酸相关性主成分分析图 . 3菜中脂肪酸合成模型 . 3油 821 与中双 9 号种子发育过程中硫甙含量随时间变化积累比较图 . 4-1 质粒图 . 4南芥生长状况随光照条件改变示意图 . 4同光照时间下的拟南芥生长状况对比图 . 4终永远拟南芥转化的光培养条件 . 4度梯度测试 . 4粒验证电泳图 . 4苗前后拟南芥生长状况比较图 . 4 A 培养基中生长的拟南芥 . 4 B 培养基中生长的拟南芥 . 4南芥 选照片 . 4 拟南芥阳性苗 证照片 . 4 拟南芥阳性苗 证照片 . 4南芥间苗过程 . 4南芥抽苔过程 . 4沾发侵染拟南芥过程 . 4南芥开花 . 4南芥结实图 . 4 转基因拟南芥 泳图 . 4基因烟草筛选阳性苗照片 . 4 烟草 泳图 . 4 烟草 泳图 . 4种与发芽 . 4培养 . 4培养基 A 上进行筛选 . 4培养基 B 上进行筛选 . 4根和移栽 . 4 油菜 泳图 . 4 油菜 泳图 . 1花中 因不同拷贝间表达及序列信息比较表 . 1种油菜培养基配方列表 . 1同选择标记下非转基