+++++SDS-PAGE常见问题分析总结

SDS PAGESDS PAGE 常见问题常见问题 1 1 配胶缓冲液系统对电泳的影响 配胶缓冲液系统对电泳的影响 在 SDS PAGE 不连续电泳中 制胶缓冲液使用的是 Tris HCL 缓冲系统 浓缩胶是 pH6 7 分离胶 pH8 9 而电泳缓冲液使用的 Tris 甘氨酸缓冲系统 在浓缩胶中 其 pH 环境呈弱酸性 因此甘氨酸解离很少 其在电场的作用下 泳动效率低 而 CL 离子却很高 两者之间形成导电性较低的区带 蛋白分子就介于二者之间泳动 由于导电性与电场强度 成反比 这一区带便形成了较高的电压剃度 压着蛋白质分子聚集到一起 浓缩为一狭窄 的区带 当样品进入分离胶后 由于胶中 pH 的增加 呈碱性 甘氨酸大量解离 泳动速率 增加 直接紧随氯离子之后 同时由于分离胶孔径的缩小 在电场的作用下 蛋白分子根 据其固有的带电性和分子大小进行分离 所以 pH 对整个反应体系的影响是至关重要的 实验中在排除其他因素之后仍不能 很好解决问题的情况 应首要考虑该因素 2 2 样品如何处理 样品如何处理 根据样品分离目的不同 主要有三种处理方法 还原 SDS 处理 非还原 SDS 处理 带有烷基化作用的还原 SDS 处理 1 还原 SDS 处理 在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT 或 Beta 巯基乙醇 后 蛋白 质构象被解离 电荷被中和 形成 SDS 与蛋白相结合的分子 在电泳中 只根据分子量来 分离 一般电泳均按这种方式处理 样品稀释适当浓度 加入上样 Buffer 离心 沸水煮 5min 再离心加样 2 带有烷基化作用的还原 SDS 处理 碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固 的保护 SH 基团 得到较窄的谱带 另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT 而防止银染时的纹理现 象 100ul 样品缓冲液中 10ul 20 的碘乙酸胺 并在室温保温 30min 3 非还原 SDS 处理 生理体液 血清 尿素等样品 一般只用 1 SDS 沸水中煮 3min 未加还原剂 因而蛋白折叠未被破坏 不可作为测定分子量来使用 3 3 SDS PAGESDS PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用 电泳凝胶中各主要成分的作用 聚丙烯酰胺的作用 丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到 电泳成功与否 与促凝剂及环境密切相关 制胶缓冲液 浓缩胶选择 pH6 7 分离胶选择 pH8 9 选择 tris HCL 系统 TEMED 与 AP AP 提供自由基 TEMED 是催化剂 催化自由基引起的聚合反应进行 十二烷基硫酸 钠 SDS 阳离子去污剂 作用有四 去蛋白质电荷 解离蛋白质之间的氢键 取消蛋白 分子内的疏水作用 去多肽折叠 4 4 提高提高 SDS PAGESDS PAGE 电泳分辨率的途径 电泳分辨率的途径 聚丙烯酰胺的充分聚合 可提高凝胶的分辨率 建议做法 待凝胶在室温凝固后 可在室温下放置一段时间使用 忌即配即用或 4 度冰箱放置 前者易导致凝固不充分 后 者可导致 SDS 结晶 一般凝胶可在室温下保存 4 天 SDS 可水解聚丙烯酰胺 一般常用的有氨基黑 考马斯亮蓝 银染色三种染料 不同染料又各自不同的染色 方法 具体可参照郭尧君编著的 蛋白质电泳技术手册 P82 103 5 5 微笑微笑 两边翘起中间凹下 形带原因 两边翘起中间凹下 形带原因 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致 多出现于较厚的凝胶中 处理办法 待其充分凝固再作后续实验 处理办法 待其充分凝固再作后续实验 6 6 皱眉皱眉 两边向下中间鼓起 形带原因 两边向下中间鼓起 形带原因 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净 处理办法 可在两板间加入适量缓冲液 以排除气泡 7 7 为什么带出现拖尾现象 为什么带出现拖尾现象 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的 处理办法 加样前离心 选择适当的样品缓冲液 加适量样品促溶剂 电泳缓冲液 时间过长 重新配制 降低凝胶浓度 8 8 为什么带出现纹理现象 为什么带出现纹理现象 主要是样品不溶性颗粒引起的 处理办法 加样前离心 加适量样品促溶剂 9 9 什么是什么是 鬼带鬼带 如何处理 如何处理 鬼带 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时 常会出现在泳道顶端 有时在 浓缩胶中 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀 主要由于还原剂在加热的过程中 被氧化而失去活性 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合 聚合成 大分子 其分子量要比目标条带大 有时不能进入分离胶 但它却于目标条带有相同的免 疫学活性 在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用 处理办法 在加热煮沸后 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇 以补充不足的还原 剂 或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化 10 10 为什么溴酚蓝有时不能起到指示作用 为什么溴酚蓝有时不能起到指示作用 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底 但蛋白质却还未跑下来的现象 主要与 缓冲液和分离胶的浓度有关 处理办法 更换正确 pH 值的 Buffer 降低分离胶的浓度 11 11 为什么电泳的条带很粗 为什么电泳的条带很粗 电泳中条带很粗是常见的事 主要是未浓缩好的原因 处理办法 适当增加浓缩胶的长度 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 6 7 适当降低 电压 12 12 为什么电泳电压很高而电流却很低呢 为什么电泳电压很高而电流却很低呢 这种现象一般初学者易出现 比如电压 50v 以上 可电流却在 5mA 以下 主要是由 于电泳槽没有正确装配 电流未形成通路 包括 a 内外槽装反 b 外槽液过少 c 电泳 槽底部的绝缘体未去掉 比如倒胶用的橡胶皮 处理办法 电泳槽正确装配即可 13 13 浓缩胶与分离胶断裂 板间有气泡对电泳有影响吗 浓缩胶与分离胶断裂 板间有气泡对电泳有影响吗 这主要出现在初学者中 一般对电泳不会有太大的影响 前者主要原因是拔梳子用 力不均匀或过猛所致 后者是由于在解除制胶的夹子后 板未压紧而致空气进入引起的 14 14 凝胶时间不对 或慢或快 怎么回事 凝胶时间不对 或慢或快 怎么回事 通常胶在 30MIN 1H 内凝 如果凝的太慢 可能是 TEMED APS 剂量不够或者失效 APS 应该现配现用 TEMED 不稳定 易被氧化成黄色 如果凝的太快 可能是 APS 和 TEMED 用量过多 此时胶太硬易裂 电泳时易烧胶 15 15 电泳时间比正常要长 电泳时间比正常要长 可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地 PH 选择错误 即缓冲系统地 PH 和被分离 物质的等电点差别太小 或缓冲系统的离子强度太高 SDS PAGESDS PAGE 电泳常见问题的分析总结电泳常见问题的分析总结 Q SDS PAGE 电泳的基本原理 电泳的基本原理 A SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS 十二烷基硫酸钠 SDS 会与变性的多肽 并使蛋白带负电荷 由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分 子量成正比而与其序列无关 因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与 多肽的大小有关 在达到饱和的状态下 每克多肽可与 1 4g 去污剂结合 当分子量在 15KD 到 200KD 之间时 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX 式中 MW 为分子量 X 为迁移率 k b 均为常数 若将已知分子量的 标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下 进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 Q 配胶缓冲液系统对电泳的影响 配胶缓冲液系统对电泳的影响 A 在 SDS PAGE 不连续电泳中 制胶缓冲液使用的是 Tris HCL 缓冲系统 浓缩胶是 pH6 7 分离胶 pH8 9 而电泳缓冲液使用的 Tris 甘氨酸缓冲系统 在浓缩胶中 其 pH 环境呈弱酸性 因此甘氨酸解离很少 其在电场的作用下 泳动效率低 而 CL 离子却 很高 两者之间形成导电性较低的区带 蛋白分子就介于二者之间泳动 由于导电性与电 场强度成反比 这一区带便形成了较高的电压剃度 压着蛋白质分子聚集到一起 浓缩为 一狭窄的区带 当样品进入分离胶后 由于胶中 pH 的增加 呈碱性 甘氨酸大量解离 泳动速率增加 直接紧随氯离子之后 同时由于分离胶孔径的缩小 在电场的作用下 蛋 白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离 所以 pH 对整个反应体系的影响是至 关重要的 实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况 应首要考虑该因素 Q 样品如何处理 样品如何处理 A 根据样品分离目的不同 主要有三种处理方法 还原 SDS 处理 非还原 SDS 处理 带有烷基化作用的还原 SDS 处理 1 还原 SDS 处理 在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT 或 Beta 巯基乙醇 后 蛋白质 构象被解离 电荷被中和 形成 SDS 与蛋白相结合的分子 在电泳中 只根据分子量来 分离 一般电泳均按这种方式处理 样品稀释适当浓度 加入上样 Buffer 离心 沸水煮 5min 再离心加样 2 带有烷基化作用的还原 SDS 处理 碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保 护 SH 基团 得到较窄的谱带 另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT 而防止银染时的纹理现象 100ul 样品缓冲液中 10ul 20 的碘乙酸胺 并在室温保温 30min 3 非还原 SDS 处理 生理体液 血清 尿素等样品 一般只用 1 SDS 沸水中煮 3min 未加还原剂 因而蛋白折叠未被破坏 不可作为测定分子量来使用 Q SDS PAGE 电泳凝胶中各主要成分的作用 电泳凝胶中各主要成分的作用 A 聚丙烯酰胺的作用 丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体 其凝固的好坏直接关系到电泳成 功与否 与促凝剂及环境密切相关 制胶缓冲液 浓缩胶选择 pH6 7 分离胶选择 pH8 9 选择 tris HCL 系统 具体作用 后面介绍 TEMED 与 AP 促凝作用 加速聚丙烯酰胺的凝固 十二烷基硫酸钠 SDS 阳离子去污剂 作用有四 去蛋白质电荷 解离蛋白质之间的 氢键 取消蛋白分子内的疏水作用 去多肽折叠 Q 提高 提高 SDS PAGE 电泳分辨率的途径 电泳分辨率的途径 A 1 聚丙烯酰胺的充分聚合 可提高凝胶的分辨率 建议做法 待凝胶在室温凝固后 可在室温下放置一段时间使用 忌即配即用或 4 度冰箱放置 前者易导致凝固不充分 后 者可导致 SDS 结晶 一般凝胶可在室温下保存 4 天 SDS 可水解聚丙烯酰胺 2 一般常用的有氨基黑 考马斯亮蓝 银染色三种染料 不同染料又各自不同的染色方 法 具体可参照郭尧君编著的 蛋白质电泳技术手册 P82 103 Q 微笑 两边翘起中间凹下 形带原因 A 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致 多出现于较厚的凝胶中 处理办法 待其充分凝固再作后续实验 Q 皱眉 两边向下中间鼓起 形带原因 A 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中 一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净 处理办法 可在两板间加入适量缓冲液 以排除气泡 Q 为什么带出现拖尾现象 为什么带出现拖尾现象 A 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的 处理办法 加样前离心 选择适当的样品缓冲液 加适量样品促溶剂 电泳缓冲液时间过 长 重新配制 降低凝胶浓度 Q 为什么带出现纹理现象 为什么带出现纹理现象 A 主要是样品不溶性颗粒引起的 处理办法 加样前离心 加适量样品促溶剂 Q 什么是 什么是 鬼带鬼带 如何处理 如何处理 A 鬼带 就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时 常会出现在泳道顶端 有时在浓缩 胶中 的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀 主要由于还原剂在加热的过程中被氧 化而失去活性 致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合 聚合成大分 子 其分子量要比目标条带大 有时不能进入分离胶 但它却于目标条带有相同的免疫学 活性 在 WB 反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用 处理办法 在加热煮沸后 再添加适量的 DTT 或 Beta 巯基乙醇 以补充不足的还原剂 或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化 Q 为什么溴酚蓝不能起到指示作用 为什么溴酚蓝不能起到指示作用 A 我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底 但蛋白质却还未跑下来的现象 主要与缓 冲液和分离胶的浓度有关 处理办法 更换正确 pH 值的 Buffer 降低分离胶的浓度 Q 为什么电泳的条带很粗 为什么电泳的条带很粗 A 电泳中条带很粗是常见的事 主要是未浓缩好的原因 处理办法 适当增加浓缩胶的长度 保证浓缩胶贮液的 pH 正确 6 7 适当降低电压 Q 为什么电泳电压很高而电流却很低呢 为什么电泳电压很高而电流却很低呢 A 这种现象一般初学者易出现 比如电压 50v 以上 可电流却在 5mA 以下 主要是由 于电泳槽没有正确装配 电流未形成通路 包括 a 内外槽装反 b 外槽液过少 c 电泳 槽底部的绝缘体未去掉 比如倒胶用的橡胶皮 处理办法 电泳槽正确装配即可 Q 浓缩胶与分离胶断裂 板间有气泡对电泳有影响吗 浓缩胶与分离胶断裂 板间有气泡对电泳有影响吗 A 这主要出现在初学者中 一般对电泳不会有太大的影响 前者主要原因是拔梳子用力 不均匀或过猛所致 后者是由于在解除制胶的夹子后 板未压紧而致空气进入引起的 一一 储存液配制储存液配制 注意配方和实际测定参数 1 2 M Tris HCl 实测 pH 8 9 0 1 25 500 mL 121 g Tris base 加 350 mL 双蒸水溶解 以玻璃棒搅拌约 1 min 缓慢加入浓盐酸 11 8 M 20 mL 继续搅拌均匀 并使 Tris 全部 溶解 溶液澄清 加入适量双蒸水至 500 mL 倒入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱保存 2 100 g L SDS 溶液 10 g SDS 要求高纯度 其质量明显影响电泳效果 加 100 mL 双蒸水 于洁净的 250 mL 烧杯中进行微波加热溶解 注意不要爆沸 间歇用玻璃棒搅拌 以加速溶解 完全溶解后的溶液应清澈透明无色 倒入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱保存 冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化 3 75 v v 甘油 于 500 mL 量筒中倒入分析纯甘油 300 mL 加双蒸水 100 mL 以 一次性塑料手套封口 颠倒量筒使甘油完全溶解 然后倒入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱保 存 4 10 g L 溴酚蓝溶液 500 mg 溴酚蓝加双蒸水 50 mL 搅拌溶解 倒入棕色玻璃试剂 瓶中 4 冰箱保存 不用过滤 用时注意吸取上层澄清液 不要吸到沉淀 二二 电泳工作液配制电泳工作液配制 省劲好用 1 Acr Bis 液 丙烯酰胺溶液 500 mL 于 800 mL 洁净的烧杯中 依次称取双丙烯酰 胺 4 g 丙烯酰胺 146 g 缓慢倒入双蒸水约 350 mL 以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解 注意 双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中 所以要称重时注意周围空气流速 称取丙烯酰胺时可以 将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖 玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并 扩散到空气中 完全溶解的溶液应清澈无色透明 待溶解完全后补加双蒸水至 500 mL 倒 入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱可保存 10 个月 2 4 分离胶缓冲液 500 mL 于 500 mL 洁净的量筒中 依次加入 375 mL 2 M Tris HCl 实测 pH 8 9 0 1 25 100 g L SDS 溶液 冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化 20 mL 最后加入适量双蒸水至 500 mL 倒入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱最少可保存 12 个月 有时冰箱温度过低会使储存液混浊 微波略微加热使其澄清后即可使用 3 100 g L 过硫酸铵溶液 ammonium persulfate AP 20 mL 2g 过硫酸铵加 20 mL 双蒸 水 倒入无色塑料试剂瓶中 4 冰箱最少可保存 10 个月 注意配胶时不要交叉污染 TEMED 可以以 5 mL 分装到 4 个无色塑料试剂瓶中分别保存 4 TEMED 成品液 购买后分装成 2 或 5 mL 小管装使用可避免母液受到污染 5 5 样品缓冲液 100 mL 依次加入 50 mL 75 v v 甘油 20 mL 100 g L SDS 溶 液 10 mL 10 g L 溴酚蓝溶液 5 mL 2 M Tris HCl 实测 pH8 9 0 1 25 5 mL 巯基乙 醇 9 mL 双蒸水 混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中 4 冰箱至少可保存 12 个月 可分装 成 10 mL 使用 不会使母液受到蛋白污染 6 10 电泳缓冲液 1000 mL 称取 10 g SDS 30 g Tris base 144g 甘氨酸 事先要明 确甘氨酸溶液的颜色 选用溶解后澄清无色的产品 于 1000 mL 的烧杯中 加水约 700 mL 溶解 可微波炉加热 80 以促进溶解 注意不要使其沸腾 加热至烧杯烫手即可 间歇用玻璃棒搅拌 分装至无色玻璃试剂瓶中 室温最少可保存 6 个月 其 pH 值约为 pH 8 4 0 1 注意可省去 pH6 8 的浓缩胶缓冲液 用 4 分离胶缓冲液 pH8 9 的替代即可 三三 12 电泳胶的配制电泳胶的配制 要注意的是 配胶时分离胶的五个组分按下表依次加入洁净的配制分离胶的小烧杯内 以 枪头搅拌约 10 20 sec 灌胶后再在胶面上小心地铺上一几毫米厚的水层 这可使凝固后的 胶面平滑整齐 然后于 37 凝固 15 30 min 而在配胶时浓缩胶只加前三个组分 混合液 要于 4 冰箱保存 待分离胶凝固后再取出加入 AP 和 TEMED 溶液 枪头搅拌均匀 灌胶 后插入梳子 然后于 37 凝固 15 30 min 凝固的胶连带其附着的玻璃板用塑料薄膜严密 包裹可在 4 冰箱保存 2 4 天 长时间保存易干胶 要重新做胶 四四 考马斯亮蓝染色和脱色考马斯亮蓝染色和脱色 极其好用 考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝染色液 1000 mL 先称取考马斯亮蓝 R250 1 0 g 于 1000 mL 试剂瓶内 加入甲醇 450mL 溶解 再加冰醋酸 100 mL 和双蒸水 450 mL 至大约 1000 mL 室温可放置 12 个月以上 染色液可倒入专用的 回收试剂瓶 届时加入适量甲醇 考马斯亮蓝和大约 10 g L 的三氯乙酸后可重复使用 考马斯亮蓝脱色液考马斯亮蓝脱色液 10 L 于 10 L 洁净塑料桶内装入工业乙醇 2 L 冰醋酸 500 mL 加入去离子水至 10 L 混匀 室 温可放置 12 个月以上 蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色 蛋白电泳凝胶的快速染色和脱色 凝胶的染色和脱色于合适体积的微波炉盒中进行 电泳后的凝胶加入染色液 以刚没过凝 胶即可 于微波炉加热约 40 70 sec 至染色液刚刚沸腾 注意塑料盒的盖子不要盖的太紧 以防染色液爆沸出 然后于脱色摇床上继续染色约 10 min 即可 染色液请倒入专用的回 收容器内 以自来水小心地淋洗凝胶冲去剩余染料 然后倒入适量的脱色液 微波加热至 刚沸腾后于染色摇床上摇动约 10 min 倒掉脱色液 此时凝胶的蛋白条带即可看清 重复 以上脱色步骤一次 即可看清电泳条带 扫描凝胶蛋白条带需要完全脱掉背景颜色 这需 要重新换上脱色液室温摇床脱色 2 h 以上 五五 蛋白上样量的选择蛋白上样量的选择 要根据具体情况决定 对于考马斯亮蓝染色 如果样品为菌体蛋白样品 有至少 50 条以上 的条带要显出来 需要上样量在 15 g 左右即可 如果蛋白条带少于 6 条 如蛋白 Marker 或纯化阶段后期的蛋白样品 上样量可减少至 2 g 即可显出清晰的条带 简化成大肠杆菌上样 大约等于 5 0 个 OD600 上样 10 15 uL 左右 注意事项 注意事项 1 SDS 与蛋白质的结合按质量成比例 即 1 4gSDS g 蛋白质 蛋白质含量不可以超标 否则 SDS 结合量不足 2 用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时 必须同时作标准曲线 不能 利用这次的标准曲线作为下次用 并且 SDS PAGE 测定分子量有 10 误差 不可完全信任 3 有些蛋白质由亚基 如血红蛋白 或两条以上肽链 胰凝乳蛋白酶 组成的 它们 在巯基乙醇和 SDS 的作用下解离成亚基或多条单肽链 因此 对于这一类蛋白质 SDS 聚 丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量 4 有的蛋白质 如 电荷异常或结构异常的蛋白质 带有较大辅基的蛋白质 不能采用该 法测相对分子量 5 如果该电泳中出现拖尾 染色带的背景不清晰等现象 可能是 SDS 不纯引起 SDS PAGE 步骤 步骤 灌注凝胶和电泳 1 根据厂家说明书安装玻璃板 2 在分离胶溶液中加入 TEMED 立即快速摇动混合并迅速往两玻璃板的间隙中灌注溶 液 留出灌注浓缩胶所需空间 梳子的齿长再加 0 5 cm 再在胶液面上小心注入一层水 约 2 3 mm 高 以阻止氧气进入凝胶溶液 3 分离胶聚合完全后 约 30 分钟 倾出覆盖水层 再用滤纸吸净残留水 4 在分离胶溶液中加入 TEMED 立即快速摇动混合并迅速往聚合的分离胶上直接灌注 浓缩胶 立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子 小心避免混入气泡 再加入浓缩胶溶液以 充满梳子之间的空隙 将凝胶垂直放置于室温下 5 浓缩胶聚合完全后 30 分钟 小心拔出梳子 把凝胶固定于电泳装置上 上下槽各 加入 Tris 甘氨酸电极缓冲液 必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡 临上样前才拔 出梳子 因为浓缩胶在电极槽液中会发生部分溶解 6 按预定顺序加样 根据样品蛋白的浓度不同 调整所使用样品的体积 使得每个样品 孔的蛋白量大致相同 同时用样品处理液调整每个孔的上样体积至基本相同 通常为 10 25 L 1 5 mm 厚的胶 7 将电泳装置与电源相接 走浓缩胶时恒压 100 V 走分离胶时恒压 140 V 电泳直至溴 酚蓝到达分离胶底部上方约 0 5 1 cm 然后关闭电源 8 从电泳装置上卸下玻璃板 撬开玻璃板 去除浓缩胶 紧靠最左边一孔 第一槽 凝 胶下部切去一角以标注凝胶的方位 然后染色 染色和脱色 将凝胶置于大平皿中 加入 30 50 mL 考马斯亮蓝染色液 放在脱色摇床上轻轻摇动 1 2 小时或过夜 将凝胶置于盛有 30 50 mL 脱色液的大平皿中 放在脱色摇床上轻轻摇动 脱色需 3 10 小时 其间更换多次脱色液直至背景清楚 对脱色后的凝胶 可进行拍照 以留永久性记录 或将凝胶干燥 制成干胶片 电泳电泳 1 将玻璃板 样品梳 Spacer 用洗涤剂洗净 用 ddH2O 冲洗数次 再用乙醇擦拭 晾干 2 将两块洗净的玻璃板之间加入 Spacer 装好玻璃板 3 按如下体积配制 10 分离胶 8 0 ml 混匀 4 向玻璃板间灌制分离胶 立即覆一层重蒸水 大约 20 min 后胶即可聚合 按如下体积配制 6 浓缩胶 3 0 ml 混匀 ddH2O 1 0 mol LTris HClpH 6 8 30 将上层重蒸水倾去 2 0 ml 400 ul 600 ul 10 SDS 10 AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 滤纸吸干 灌制浓缩胶 插入样品梳 7 装好电泳系统 加入电极缓冲液 上样 20 l 8 稳压 200V 溴酚蓝刚跑出分离胶时 停止电泳 约需 45 min 1hr 9 卸下胶板 剥离胶放入染色液中 室温染色 1 2 hr 加入脱色液 置于 80 rpm 脱色摇 床上 每 20 min 更换一次脱色液 10 ml 冰乙酸 45 ml 乙醇 45 ml 蒸馏水 至完全脱净 SDS PAGE 胶的干燥胶的干燥 凝胶干燥时遇到的主要问题是凝胶的变形和破裂 将凝胶放在 Whatman 3MM 滤纸上 可防止干燥凝胶变形 但凝胶是否破裂取决于凝胶的厚度和干燥器的质量 因此 应尽量 使用薄胶并使凝胶干燥器处于良好状态 使其