荧光共振能量转移

FRET 技术研究 PEDF 和目标蛋白 之间在小鼠神经元 神经胶质细胞 的 相互作用 一 一 FRETFRET 技术基本原理技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时 当供体分子吸收一定频率的 光子后被激发到更高的电子能态 在该电子回到基态前 通过偶极子相互作用 实现 了能量向邻近的受体分子转移 即发生能量共振转移 FRET 是一种非辐射能量跃迁 通过分子间的电偶极相互作用 将供体激发态能量转移到受体激发态的过程 使供体 荧光强度降低 而受体可以发射更强于本身的特征荧光 敏化荧光 也可以不发荧 光 荧光猝灭 同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长 能量转移的效率和供体 的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度 供体与受体的跃迁偶极的相对取向 供体 与受体之间的距离等因素有关 作为共振能量转移供 受体对 荧光物质必须满足以 下条件 受 供体的激发光要足够分得开 供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上 成功地 应用于核酸检测 蛋白质结构 功能分析 免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方 面 传统有机荧光染料吸收光谱窄 发射光谱常常伴有拖尾 这样会影响供体发射 光谱与受体吸收光谱的重叠程度 而且供 受体发射光谱产生相互干扰 最新的一些 报道将发光量子点用于共振能量转移研究 克服了有机荧光染料的不足之处 相对于 传统有机荧光染料分子 量子点的发射光谱很窄而且不拖尾 减少了供体与受体发射 光谱的重叠 避免了相互间的干扰 由于量子点具有较宽的光谱激发范围 当它作为 能量供体时 可以更自由地选择激发波长 可以最大限度地避免对能量受体的直接激 发 通过改变量子点的组成或尺寸 可以使其发射可见光区任一波长的光 也就是说 它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体 并且保证了供体发射波长与受 体吸收波长的良好重叠 增加了共振能量转移效率 以 GFP 的两个突变体 CFP cyan fluorescent protein YFP yellow fluorescent protein 为例简要说明其原理 CFP 的发射光谱与 YFP 的吸收光谱有相当的重叠 当 它们足够接近时 用 CFP 的吸收波长激发 CFP 的发色基团将会把能量高效率地共振转 移至 YFP 的发色基团上 所以 CFP 的发射荧光将减弱或消失 主要发射将是 YFP 的荧 光 两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的 6 次方成反比 对空 间位置的改变非常灵敏 例如要研究两种蛋白质 a 和 b 间的相互作用 可以根据 FRET 原理构建融合蛋白 这种融合蛋白由三部分组成 CFP cyan fluorescent protein 蛋白质 b YFP yellow fluorescent protein 用 CFP 吸收波长 433nm 作为激发波 长 实验灵巧设计 使当蛋白质 a 与 b 没有发生相互作用时 CFP 与 YFP 相距很远不能 发生荧光共振能量转移 因而检测到的是 CFP 的发射波长为 476nm 的荧光 但当蛋白 质 a 与 b 发生相互作用时 由于蛋白质 b 受蛋白质 a 作用而发生构象变化 使 CFP 与 YFP 充分靠近发生荧光共振能量转移 此时检测到的就是 YFP 的发射波长为 527nm 的荧 光 将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达 这样就可以在活 细胞生理条件下研究蛋白质 蛋白质间的相互作用 黄色荧光蛋白报告载体 如下图 青色荧光蛋白报告载体 如下图 一 质粒的选择及载体构建 订购 1 带有 Sal I 和 Sac II 两个酶切位点的小鼠 PEDF 过表达克隆质粒 2 带有 Kpn I 和 Xba I 两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质 粒 3 pECFP C1质粒 4 pEYFP C1 质粒 5 Sal I Sac II Kpn I Xba I 内切酶 6 dna 合成酶等 二 PEDF 核青色荧光蛋白 pECFP C1 表达载体的构建及鉴定 小鼠 c57PEDF 序列 blst 获得 1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag 61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag 121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc 181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct 241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctctgg gagctgaaca tcgaacagag 301 tctgtcattc accgggctct ctactacgac ctgatcacca accctgacat ccacagcacc 361 tacaaggagc tccttgcctc tgttactgcc cctgagaaga acctcaagag tgcttccaga 421 attgtgtttg agaggaaact tcgagtcaaa tccagctttg ttgcccctct ggagaagtcc 481 tatgggacca ggccccggat cctcacgggc aaccctcgag tagaccttca ggagattaac 541 aactgggtgc aggcccagat gaaagggaag attgcccggt ccacgaggga aatgcccagt 601 gccctcagca tccttctcct tggcgtggct tacttcaagg ggcagtgggt aaccaagttt 661 gactcgagaa agacgaccct ccaggatttt catttggacg aggacaggac cgtgagagtc 721 cccatgatgt cagatcctaa ggccatctta cgatacggct tggactctga tctcaactgc 781 aagattgccc agctgccctt gacaggaagt atgagcatca tcttcttcct gcccctgacc 841 gtgacccaga acttgaccat gatagaagag agcctcacct ctgagttcat tcatgacatc 901 gaccgagaac tgaagactat ccaagctgtg ctgactgtcc ccaagctgaa gctgagcttc 961 gaaggcgaac ttaccaagtc tctgcaggac atgaagctac agtcgttgtt tgaatcaccc 1021 gacttcagca agattactgg caaacccgtg aagctcaccc aagtggaaca cagggctgct 1081 ttcgagtgga atgaagaggg ggcaggaagc agccccagcc caggcctcca gcccgtccgc 1141 ctcaccttcc cgctagacta tcaccttaac caacctttcc tctttgttct gagggacacg 1201 gacacggggg ccctcctctt cataggcaga atcctggacc ccagtagtac ttaa 分别在上游引物序列的5 端和下游引物的5 分别加入Sal I和Sac II两个酶切位点序列 设计引物序列如下 Primer F 5 GTCGAC atgcaggccctggtgctact 3 Primer R 5 CCGCGG ttaagtactactggggtcca 3 其中GTCGAC为酶切位点Sal I CCGCGG为酶切位点Sac II 引物中未 加入保护碱基 具体构建质粒 pECFP C1 pedf 步骤 1 pedf 片段的 pcr 扩增 提取和纯化 2 有文献报道利用一次中间载体 topo 载体的构建可以相对容易的 将 pedf 构建到 pECFP C1 中 不知道这个实验需要不需要做这一 步 3 pECFP C1 质粒的扩增 提取和纯化 4 pECFP C1 质粒的酶切 5 pECFP C1 片段的去磷酸化用去磷酸化试剂盒 Cloned Alkaline Phosphatase CIAP 将 pECFP C1 片段切口去磷酸化 不知道是 不是必须做这一步 6 pECFP C1酶切片段的纯化 4 7kb 试剂盒 琼脂糖凝胶DNA PCR 产物小量回收试剂盒 TaKaR A DV805A 1 2 琼脂糖凝胶回 收的DNA量应大于200ng ul 7 pECFP C1 pedf质粒的连接和转化 8 pECFP C1 pedf 质粒的扩增 提取和纯化 菌液 pcr 9 pECFP C1 pedf 质粒的鉴定 送公司测序 三 目标蛋白基因序列及引物设计 分别在上游引物序列的5 端和下游引物的5 分别加入Kpn I和Xba I两个酶切位点序列 设计引物序列如下 Primer F 5 ATGGTACC 3 Primer R 5 ATTCTAGA 3 其中GTCGAC为酶切位点Kpn I CCGCGG为酶切位点点Xba I 引物 中5 端加入保护碱基AT pEYFP C1 目标蛋白载体的构建与上述步骤类似 四 阳性对照质粒pECFP C1 YFP的构建及鉴定 Primer F 5 GTCGACATGGTGAGCAAG 3 Primer R 5 CCGCGGTCTAGATCCGGTG 3 其中GTCGAC为Sal I酶切位点 CCGCGG为Sac II酶切位点 载体具体构建过程与上述过程相同 五 PEDF和目标蛋白在神经细胞 或胶质细胞 中的FRET研究 1 神经细胞 或胶质细胞 的培养 2 PEDF蛋白和目标蛋白在神经细胞 或胶质细胞 中的免疫荧光定 位 将神经细胞 或胶质细胞 均匀种植在petri皿里 24h后待细 胞贴壁 PBS液洗细胞3次 再用4 多聚甲醛固定15min PBS液洗3 次 用0 5 Triton穿孔15min 再用PBS洗3次每次5min 然后用 I BSA封闭30min 将petri皿小室内液体吸干净 加入用I BSA按 1 1000稀释好的PEDF和目标蛋白抗体 4 过夜后 用PBS洗3次 加入二抗 37 C孵育1h 用PBS洗3次 此过程注意避光 加 200ulFluo Anti fading medium防止荧光淬灭 在共聚焦显微镜下 观察 3 荧光融合蛋白在神经细胞 或胶质细胞 中的表达 质粒转染48h后荧光显微镜下观察并拍照后 细胞提取总蛋白进 行免疫蛋白印迹分