角膜组织工程

疑问,（1）到底什么是角膜？,（2）常说的角膜移植是怎么回事？,（3）角膜移植中的角膜来源于哪里？,（4）盲人，近视，远视，白内障都可以进行角膜移植而恢复视力吗？,角膜,眼角膜是眼睛前端一层透明薄膜 ，角膜完全透明，位于眼球前部，呈横椭圆形。角膜有十分敏感的神经末梢，如有外物接触角膜，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。,角膜分为五层，组织学上从前向后分为：上皮细胞层：厚约35m，由56层鳞状上皮细胞组成，无角化，排列特别整齐，易与其内面的前弹力层分离；前弹力层：厚约12m，为一层均质无细胞成分的透明膜；,基质层：厚约500m，占角膜厚度的90%，由近200层排列规则的胶原纤维束薄板组成，其间有角膜细胞和少数游走细胞，并有粘蛋白和糖蛋白填充；后弹力层：为较坚韧的透明均质膜，成年人厚约1012m；内皮细胞层：厚5m，为一层六角形扁平细胞构成，细胞顶部朝向前房，基底面向后弹力层。,角膜移植,概念 用正常的眼角膜替换患者现有病变的角膜，使患眼复明或控制角膜病变，达到增进视力或治疗某些角膜疾患的眼科治疗方法。,适用症状,适合于各种原因造成的角膜混浊或水肿而严重影响视力的病变 。例如：病毒性角膜炎 被酸、碱化学物烧伤的角膜混浊患者 先天性角膜变性、圆锥角膜、角膜基质变性、角膜内皮细胞功能失代偿等患者 角膜肿瘤、角膜瘘、角膜葡萄肿患者 已失明的角膜白斑患者,材料来源,传统 现代,活体捐赠,尸体捐赠,活体捐赠,尸体捐赠,人工角膜,活体捐赠顾名思义供体是活人，因外伤、视神经疾患、颅内疾患等原因导致失明（无光感）而角膜却是完好无损的眼球，均是合适的供体。,返回,人工角膜,基本简介世界上超过1000万人的眼盲是由角膜病引起，为导致眼盲的第二大原因，仅次于白内障。其中80%可以通过角膜移植手术脱盲。然而，传统的角膜移植手术有其两大弊端，一是角膜供体的来源困难，二是手术成功率低。人工角膜的出现及应用为角膜盲患者带来了希望。,基本结构,人工角膜是用医用高分子材料制成的类似人体角膜的产品 。人工角膜材料,无机材料,有机材料,生物材料,玻璃，羟基磷灰石，生物玻璃陶瓷,硅凝胶，聚甲基丙烯酸甲酯 ，氟碳多聚体,羊膜，动物胶原和壳聚糖，黏多糖,组织工程角膜,光学镜柱,周边支架,聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、硅凝胶、玻璃,陶瓷、氟碳聚合物、羟基磷灰石、生物材料、聚四氟乙烯,角膜设计中，较为成功的是AlphaCor、Dohlman-Doan和Osteo-Odonto， 并获得了FDA 批准，进入临床阶段。,种子细胞特点,（1）具有较高的增殖能力 （2）能够长期维持其生理功能和生物活性,种子细胞（角膜缘干细胞）,1.取材 取一块大小为12mm2，深度为基质前的角膜缘组织一块。,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,2.培养 采用组织块培养法和酶消化法。所用的培养基采用DMEM与F12培养基1：1混合，加入10胎牛血清，5ng/ml的胰岛素，10 ng/ml的上皮生长因子。消化酶使用0.25胰蛋白酶0.02EDTA的混合物。,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,观察培养细胞的生长情况 23天换液一次，在倒置显微镜下观察角膜缘上皮细胞的生长情况。 培养细胞标记物染色 将培养的角膜缘上皮细胞固定，进行间接免疫组织化学染色。选用AE5抗角蛋白抗体，特异性识别角蛋白K3；4A4核转录因子p63的特异性抗体,特异性识别p63。,3.移植,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,角膜缘干细胞理论的建立,1971年，Davanger等研究发现角膜缘是角膜上皮增殖和移行的动力根源，据此提出角膜缘干细胞存在的假说 。1986年，Schermer等首次通过试验发现角膜缘基底细胞缺乏特异性分化蛋白K3，为角膜缘干细胞的解剖部位提供了间接依据。,角膜缘干细胞的解剖定位,角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界的部分 在基底部乳头形成特殊的“栅栏”(limbal palisades of vogt)样结构,结膜 角膜缘 周边角膜 中央角膜,角膜缘干细胞理论建立的意义,认知了多种眼表疾病的发病机理找到了许多眼表重建手术及角膜移植术失败的原因,角膜缘干细胞移植的意义,角膜缘干细胞移植是角膜缘干细胞缺乏患者恢复眼表完整性和重建边缘屏障作用的有效方法。,角膜缘干细胞移植的局限性,异体供眼来源有限，而且存在免疫排斥反应，可能导致移植失败。对单眼角膜缘干细胞受损患者的健眼取材（大于2/3圆周）有造成健眼角膜缘干细胞缺乏的潜在威胁 。因此目前认为对角膜缘干细胞先行体外培养扩增后再行移植术是非常有前景的治疗方法。,Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1301,载体支架的特点,（1）生物相容性好 ；（2）细胞能够正常生长且形成近似体内器官的正常结构 ；（3）具备角膜特有的透明，透光，透氧的特性 ；,目前常用的载体支架,1 羊膜2 胶原3 纤维蛋白4 脱细胞角膜基质5 甲壳素与壳聚糖,羊膜,当胚体下沉，其周围的外胚层和中胚层向上突起形成羊膜褶，头褶、尾褶向上生长，侧褶向胚体背中部集中，最后，这些褶全部在胚体尾端背部会合，将胚体全包在膜内，内层称羊膜，羊膜腔内有羊水，外层称浆膜，这两层膜在会合处形成浆羊膜缝。,生物羊膜,羊膜的制备和保存,将胎盘取出后，立即在层流罩下用含50mg/L青霉素、50mg/L链霉素、100mg/L新霉素及25mg/L两性霉素的平衡盐溶液清洗表面凝血块.从绒毛膜间的潜在腔隙中钝性分离出羊膜，将其上皮面朝上，平铺于0.45m微孔硝酸纤维素膜上，切成3cm4cm大小，储藏于-80，含有Eagle基质和甘油（11）混合液的无菌瓶内备用。鉴于羊膜的制作和保存条件不足所带来的医用安全问题，灭菌生物羊膜已上市并投入使用.,羊膜作为移植底物，是提供基质，而不是移植上皮活细胞.羊膜中含有型胶原蛋白（与结膜中型胶原蛋白相同，可刺激杯状细胞的分化）、整合素及板层体等多种成分，是结膜上皮化的合适附着物，为病变组织提供健康的上皮下基质环境.,展望,理想人工角膜应具有以下特点：优良的光学特性，稳定的物理化学性质。 能