免疫组织化学染色技术20140413

熟悉而又陌生的世界免疫学,制作,内容,医 学 免 疫 学,第27章 免疫组织化学技术,主讲教师：王兴名,主讲教师：王兴名,主讲教师：王兴名,主讲教师：王兴名,2014-04-15,主讲教师：王兴名,指导教师：王洪江老师,35岁女性，左颈淋巴结肿大，CT扫描未发现原发灶？临床如何处理？,实例,行免疫组化染色：肿瘤细胞CK7（-），CK20(+)，CDX2（+），提示结直肠来源。,免疫组化：协助临床诊断！,活检：提示为腺癌（转移性）,肠镜检查在横结肠发现12mm的病灶，活检证实为腺癌。（ CK7和CK20联合应用）,某些免疫标志物决定是否使用靶向药物治疗,免疫组化-指导临床治疗方向！,有利于课题设计和研究工作的开展！,？,免疫组织化学技术,第27章 免疫组织化学技术Immunohistochemistry,第五节 免疫金银法,第四节 荧光免疫组织化学技术,第三节 酶免疫组织化学染色,第二节 免疫组织化学的关键技术,本章主要内容,第一节 概述,第一节 概述,第二节 免疫组织化学的关键技术（学习难点）,第三节 酶免疫组织化学染色,本次课程任务,免疫组化的概念及原理 （重点掌握）,免疫组化分类（了解）,常用免疫组化方法（熟悉）,免疫组化特点（熟悉）,【教学目的与要求】,教学目的： 免疫组织化学染色技术是一项非常成熟的蛋白检测技术，广泛应用于临床检测，其所应用的抗原抗体反应，更是很多其他免疫实验的理论基石。因此通过本次授课，要让同学掌握该项实验原理，做到融会贯通。教学要求： 掌握免疫组织化学染色技术的概念和原理； 熟悉免疫组织化学染色技术的步骤、方法及操作步骤。 了解免疫组化技术的重要用途及相关其他技术（拓展）。,第一节 概述,一、免疫组织化学的概念及原理（重点掌握）,（一）概念 ：免疫组织化学 immunohistochemistry,将显示剂（荧光素、酶、金属离子等）标记的特异性抗体在组织或细胞原位通过抗原抗体的特异性反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性及定量测定的一项技术。 综合两门技术，并借助显微镜检测各种物质。,本质：组织化学染色+原位示踪技术发展历程：免疫荧光法-酶标抗体技术酶抗酶复合物技术胶体金标记技术以及亲和标记技术-出现原位杂交技术及PCR技术。,（二）免疫组织化学原理（重点掌握）,1.（回顾）理论基础：（1）抗原（antigen）,是一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。,两大特性：免疫原性、免疫反应性。,外源性抗原：微生物、花粉等内源性抗原：隐蔽的自身抗原、肿瘤相关抗原等同种异型抗原：人类白细胞抗原、血型抗原异嗜性抗原：人与其他动物、植物等之间存在的共同抗原,抗原处处在,（2）抗体（antibody）机体受抗原刺激后由B淋巴细胞,特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生特异性反应的球蛋白，称为免疫球蛋白。 特性：能够与相关抗原特异性结合。,（3）酶促反应：II抗用酶标记（如辣根过氧化物酶等），与底物发生酶促反应。,酶促反应的特点：高效性 特异性 操作简单 条件可控。,总结：（1）+（2）+（3）=免疫组织化学的优点：,免疫反应+组织化学 结合的产物,1.利用了免疫学基本原理：抗原与抗体结合的高度特异性,2.借助化学显色方法,2.免疫组化染色原理：,具体的反应原理?,提取靶蛋白（作为抗原）,获得鼠I抗,获得II抗,根据标记抗体种类不同,根据染色步骤分类,根据结合方式：抗原抗体结合： 如：过氧化物酶-抗过氧化物酶法（PAP法） 亲和连接,二、免疫组织化学分类,酶-免疫酶法 荧光染料-免疫荧光法 铁蛋白-免疫铁蛋白法 胶体金-免疫金银法 放射性同位素-放射免疫法,根据标记抗体不同：,根据染色步骤,直接法：例-免疫荧光探针间接法：是将酶标记在第二抗体或与第二抗体具有亲和性的某种分子上，检测组织或细胞内的特异性抗原物质。 例：两步法，三步法及多步法 优点：提高灵敏度，同时避免多次标记I抗,图例,间接法:灵敏性三步法、两步法,直接法：特异性一步法,根据结合方式：,抗原-抗体结合：例如过氧化物酶-过氧化物酶复合物法亲和连接法：ABC法 S-P法,免疫荧光法,免疫酶标方法,免疫胶体金技术,三、较常用的免疫组织化学方法,1.原理：抗原抗体特异性结合 用荧光素标记I抗进行反应。2.特点：荧光显微镜下观察,免疫荧光法,1.目前应用最为广泛2.原理：抗原抗体反应，酶标记抗体，加底物显色3.特色：准、清、久、兼容。,免疫酶标方法,1.标记物：特殊的金属颗粒-胶体金2.特性：特别适用于电镜的单标记或多标记。也适用于光镜研究。,免疫胶体金技术,电子显微镜胶体金包埋后染色,四、免疫组化技术特点：（熟悉）,1.原位性2.显色反应3.形态、代谢和功能三结合4.定性、定位和定量三位一体5特异性强6.敏感性高,原始位置的反应：细胞层面膜、核、浆 细胞器层面,2.显色反应,根据标记的种类不同，显色效果不同： 荧光标记-荧光素显色 酶标记-酶底物显色 胶体金技术光镜、电镜均显色,1.原位性,形态显色反应代谢、功能抗原含量及位置,4.定性、定量及定位三位一体,存在吗？在哪里？有多少？,3.形态、代谢和功能三结合,原理决定该特点“免疫组织化学实际是组织中特定抗原的显示！”,6、敏感度高,ABC法、SP法可使抗体稀释上千倍、上万倍后仍可与组织中抗原结合。,5.特异性强,小结,免疫组化技术的原理,用下图来说明以上基本原理：,免疫组化具体怎么做的呢？,Company Logo,第二节、第三节 免疫组织化学技术基本步骤（难点，实用性强）,长,时间：标本离体后30min内取材，并用固定液固定；目的：保持组织的形态和结构的完整；尽量保存组织中的抗原方法：4%甲醛溶液机理：使蛋白质发生交联而起固定作用 ,影响细胞膜通透性,抑制酶的消化作用，从而保护蛋白质免受破坏）,1.取材、固定,2.组织包埋,目的：使组织保持一定的形状和硬度, 易于切片方法：有多种，如石蜡包埋、冷冻包埋、塑料包埋等,切片： 4um厚度（相当于单层细胞厚度），并粘附于载玻片。烤片： 70 2h，目的-充分贴附,3.制片,4.脱蜡,脱蜡：二甲苯溶液， 6min*5次，再用乙醇洗掉二甲苯水化、洗涤：PBS浸泡 5min,目的：暴露抗原,提高通透性,增强特异性染色方法：高压修复，柠檬酸钠盐缓冲液，PH=6.0 , 0.01M 另外其他方法：消化酶修复、微波修复、煮沸等等。PBS洗涤 3次,5.灭活,6.抗原修复,3%H2O2溶液，室温10min，以消除内源性过氧化物酶的活性,目的：消除非特异性染色（存在内源性荧光、内源性酶，内源性生物素、抗体或标记物不纯、过量等）方法：正常山羊血清封闭液封闭，室温下，10min。倾去血清,适当比例稀释I抗，37孵育1h或4冰箱过夜。PBS洗涤 2min*3次,7.血清封闭,封闭后勿洗涤！,8.特异I抗孵育,9.II抗孵育,滴加生物素化II抗工作液50-100ul室温孵育20分钟，PBS洗涤2min*3次,11、滴加显色剂：如DAB ，室温，5min左右。注意：光镜下掌握染色时间；流水冲洗 5min,10.滴加底物,采用的方法不同，底物有一定差异.,后面详细分析,11.滴加显色剂,苏木素复染（细胞核0.1%盐酸-乙醇溶液分化,12.复染,13.“成片”,流水充分冲洗梯度酒精脱水中性树胶固定，封片，晾干后镜检。,结果判读要考虑以下几个方面 A、定位：细胞质（为主），细胞膜，细胞核，细胞间质 B、阳性细胞数 C、染色强度,最后一步：结果判读,光学显微镜下结果判断判读举例：,食管鳞状细胞癌 CD44蛋白强阳性表达，表达位置：细胞质,乳腺癌，癌细胞核内ER强阳性表达,在有转移的HCC中，VEGF呈强阳性表达 ABC 200,人甲状腺癌CD44V6染色，胞膜阳性，SP法，DAB染色,ABC法,抗生物素-生物素免疫染色法,理论基础：卵白素：亦程抗生物素，亲和素。有四个同生物素亲和力极高的结合点。,生物素：即机体内维生素H。 1.可以与卵白素高亲和力结合； 2.可以和抗体IgG的Fc段结合，但不影响抗体活性； 3.活化后可与过氧化物酶等结合，也不影响酶活性,ABC试剂盒,ABC试剂盒,1 .封闭用血清2.生物素标记II抗3.A试剂： 卵白素（抗生物素）4.B试剂：生物素-过氧化物酶复合物,P-O,Antigen,Biotin,Avidin,HRP,Illustration of ABC method,sp法,基本原理与ABC法相似，但与ABC法稍有不同：是采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原,Biotin,Streptavidin,Enzyme: HRP or AP,Illustration of SP method, EnVison系统染色原理,II抗,多聚螯合物酶,形成多聚螯合物,含有大量酶和II抗分子放大效果好背景着色极浅,Ag,Ag,Primary antibody,Secondary antibody,Enzyme, AP or HRP,Illustration of EnVision method,小复习：,组织内抗原,酶标II抗,特异性I抗,显色剂, 免疫组织化学在临床诊疗中的应用（了解）,用于鉴别肿瘤的组织来源细胞受体检测病毒性抗原检测癌基因、抑癌基因蛋白与生长因子检测重新认识某些肿瘤的组织发生、发病机制,器官或组织特异性抗原标记物,前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1甲状旁腺：PTH黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A肝细胞癌标记物：Hep-1乳腺： Mammaglobio，GCDFP15结肠： CDX2，B-catenin宫颈癌：P16,癌可能的起源,较常见的临床情况：淋巴结或其它部位不明起源的转移癌卵巢腺癌，怀疑为胃肠道癌转移膀胱腺癌，怀疑为侵犯/转移的前列腺癌或结肠癌有结肠癌病史的患者肺部有一孤立性结节：结肠癌转移还是新的肺原发性肿瘤？,卵巢腺癌：原发还