实验二乙肝鉴定

免疫学技术 Immunological Techniques 乙肝表面抗原检验 2012级本科 讲义 实验二 一、背景知识 Background knowledge 抗原 -抗体反应特点 特异性 可逆性 浓度适宜 两个阶段 抗原 -抗体结合 免疫 复合体形成 影响抗原抗体反应的因素 Factors affecting the antigen-antibody reaction 离子强度 温度 酸碱度 浓度 抗体的制备 Antibody production 抗血清 单克隆抗体 基因工程抗体 单克隆抗体的制备 Preparation of monoclonal antibodies SARS H5N1流感 狂犬病 埃博拉出血热 毒蛇咬伤 Q：为什么在今天，血清疗法依然非常有价值？ 人源化抗体的合成Production of human or humanized antibodies基于 抗体的免疫检测技术 The use of antibodies in immunoassays 基于免疫复合体 Immune complexes 凝集反应、免疫沉淀 血凝抑制、免疫印迹 基于抗原抗体对 Antibodyantigen pair 免疫标记技术 蛋白质芯片技术 血凝抑制检验 The hemagglutination inhibition assay 可用于检验流感，麻疹等病毒 可进行定量检测，不会引起病毒扩增 免疫印迹 Western blot （ Immunoblotting） 免疫沉淀 Immunoprecipitation (IP) 抗原抗体复合物与 G/A蛋白结合后形成沉淀而析出 IP免疫印记 IP-Western Blotting 先用免疫沉淀法纯化样本 再用免疫印迹法分离样本 最后用免疫荧光技术测定样本 放射免疫技术 Radioimmunoassay (RIA) 竞争抑制 Competitive inhibition 免疫荧光技术 Immunofluorescence techniques Q:对过敏性紫癜 HSP患者的组织切片进行免疫荧光技术检验，可见皮肤血管壁荧光强烈。 这是 为什么？ 酶联免疫技术的发展 Development Of An Enzyme-Linked. Immunosorbent Assay (ELISA) 放射免疫技术 1960年 免疫荧光技术 1941年 酶联免疫技术 1971年 多路阵列技术 2007年 等离子增强 ELISA技术 （使用纳米技术，等离子表面共振技术） 2012年 10月 间接法 Indirect ELISA 包被待测抗原，封闭 加入一抗，冲洗 加入 二抗 ，冲洗 加入 显色剂 ，显色 检验包被能力差的抗原时结果存在偏差 二抗及显色部分可通用，成本较低 夹心法 Sandwich ELISA 包被特异一抗，封闭 加入抗原，冲洗 加入 酶标抗体 ，冲洗 加入 显色剂 ，显色 检验小分子抗原时受表位空间限制结果存在偏差 仅需较少数量的抗原，灵敏度高 竞争法 Competitive ELISA 用抗体孵育待测抗原 包被样本抗原，封闭 加入抗原抗体复合物，冲洗 加入 二抗 ，冲洗 加入 显色剂 ，显色 价格稍贵 适合检验极少数量的待测抗原，灵敏度高。可酶联抗体或抗原。 ELISA技术的应用 Applications of ELISA 蛋白定量分析 检验过敏源 检验特异性抗体 检验病毒抗原 常见检测例： 乙肝两对半 结核分歧杆菌抗体 HIV抗体 实验二 乙肝表面抗原检验 Hepatitis B Surface Antigen (HBsAg) Assays 二、实验目的 The purpose of this experiment 掌握 ELISA双抗体夹心法的 原理 利用 ELISA检测试剂盒对乙型肝炎病毒表面抗原进行诊断。 三、实验原理 The experiments principles 待检样本中的抗原 与载体 上的特异性抗体结合后，可继续结合酶标抗体。加入底物时，底物被酶分解成 有色 产物。 结合 的酶量 与样本中抗原的 量 成正比 ， 有色 产物的量与酶量 成比例，所以有色 产物的量 与样本中抗原的量 直接相关 四、实验步骤 The experimental method 1.材料 与 试剂 Materials and reagents 蒸馏水 、一次性手套、移液器和 无菌吸头、干净的吸水纸、 37 恒温箱 乙肝 病毒表面抗体诊断试剂 盒：预 包被反应板 1块，酶 结合物 1瓶，阳性 对照 1 瓶，阴性 对照 1 瓶，浓缩 洗涤液 1 瓶，显色剂 A 1 瓶，显色剂 B 1 瓶，终止 液 1 瓶，封 板胶纸 2片 2.具体步骤 Procedure for the ELISA test （ protocol） （ 1）从冰柜中取出试剂盒，室温平衡 30min,同时将浓缩洗涤液做 1:20稀释 （ 2）加待测标本：取足够数量的酶标包被板，固定于框架上，分别设置阳性孔、阴性孔各 1个分别加入阴阳性对照各 0.1ml、空白对照孔 1个，另 3个标本孔分别加入待测标本 0.1ml，记录各孔 位置 （ 3）加酶结合物：每孔加 0.1ml，空白对照不加，充分混匀，置 37 孵育 30min （ 4）洗板：手工洗板，弃去反应板孔内的液体，在吸水纸上拍干；用洗涤液注满每孔静止 5-10s,弃去孔内洗涤液拍干，如此反复 5次，拍干 （ 5）加显色剂：先加显色剂 A，每孔0.05ml；再加显色剂 B，每孔 0.05ml；充分混匀，放置 37 避光孵育 30min （ 6）终止反应：每孔加入终止液 0.05ml，混匀 （ 7）测定：以空白孔调零，在终止后 10分钟内，用 450nm波长测量各孔的吸光值(OD值 )或肉眼观察颜色变化。 3.注意事项 Assay precautions 1.检验方法中洗板的质量至关重要，既 避免洗液过量溢出 ，又能充满反应微孔中，洗板次数应不少于 5次； 2.洗板时避免使用带纸屑吸水纸， 勿反复使用 ； 3.检测标本尽量避免反复冻融、溶血或长菌，否则可能影响检测结果。 4.各种试剂使用前要混匀；部分溶液 (如洗液等 )如有结晶析出，轻微加热或摇匀溶液后不影响使用。 5.反应板开封后不能一次用完时，将剩余板条和干燥剂同时放入塑料袋内封好，置 2 8 可短期保存。 五、结果分析 The analysis and interpretation of experimental results 1 阴性结果表明样本中不含HBsAg，或样本中 HBsAg的含量低于检测范围 2 阳性结果表明样本中含有HBsAg，或非特异性反应，需经过复检再确认 3 阳性结果如复检为阴性结果应被认为是阴性标本多由试剂交叉污染引起 六、讨论与提高 Discussion 1，乙肝表面抗体阳性的患者一定是乙肝患者吗，为什么？ 2，举例说明 在 ELISA检验中，哪些步骤发生失误会导致检验结果呈假 阳性 提示：从检验的六个具体步骤考虑 3， 为什么科研上