生物安全柜的正确使用和维护PPT课件.ppt

生物安全柜的正确使用和维护浙江省疾病预防控制中心翁景清 1 第一节选型原则 1 根据工作性质病原微生物危害程度有无毒挥发性气体是否涉及放射性物质2 具备医疗器械注册证3 产品质量与品牌 2 医疗器械分类 3 医疗器械注册证 4 BIBASE生物安全柜 B2型 5 前言 生物安全柜 BiosafetyCabinet BSC 在生物因子操作过程中用来保护操作人员 环境和 或 实验物品 防止其暴露于实验中 可能 产生的危险性或潜在危险性生物气溶胶或溅出物的负压通风装置 是微生物实验室的重要设备 保护操作者和环境 有些保护物品 属一级安全隔离屏障 关系人体生命安全 要求非常严格 在SARS后 大量使用安全柜 6 安全柜标准 EN12469 2000Biotechnology Performancecriteriaformicrobiologicalsafetycabinets 生物技术微生物安全柜性能标准 NSF ANSI49 2004Class laminarflow biosafetycabinetry 级 层流 生物安全柜 制定我国的标准 国家食品药品监督管理局发布的 生物安全柜 YY0569 2005 行业标准 发布 2005 07 18实施 2006 06 01生物安全柜 170 2005 中华人民共和国建设部发布 建筑工业行业标准 2006 06 01实施 7 第二节中国标准和欧美标准比较 2006年6月1日 中国医药行业标准YY0569 2005正式实施了 这是国家食品药品监督管理局 SFDA 于2005年7月18日发布的医药行业关于生物安全柜的强制性标准 据行业人士认为 这个标准的实施将会引发中国生物安全柜行业的重新洗牌 8 标准YY0569 2005正式实施 是国家食品药品监督管理局 SFDA 于2005年7月18日发布的医药行业关于生物安全柜的强制性标准 不同于2005年6月1日实施的由建设部编制的 生物安全柜 JG170 2005的建设工业行业标准 医药行业的YY0569 2005标准的编制是参照欧洲标准化委员会 CEN 颁布的生物安全柜欧洲标准EN12469 2000和由美国国家标准学会 AmericanNationalStandardInstitute ANSI 官方认可的美国NSF49生物安全柜标准 9 YY0569 2005的行业标准积极吸收采纳了EN12469和NSF49这两个生物安全柜标准中的重要部分 并将这两个标准中相对薄弱的部分作出了提高修改 使中国的YY0569 2005标准成为世界上生物安全柜领域最权威的标准 10 一 安全柜型号方面 中国YY0569 2005采取了和美国NSF49 2002相同的规定 将二级安全柜细分成四个型号首先 这三个标准对生物安全柜的大分类以及性能要求方面都有相同的规定 对于二级生物安全柜的分类标准方面 中国YY0569 2005标准和美国NSF49标准一样 不同于欧洲EN12469标准 11 从最基本的方面来说 三种类型安全柜都可以提供对操作人员 试验品和工作环境的保护 工作原理也相同 最大的区别是EN12469只对 二级生物安全柜 有一个基本的定义 而YY0569同NSF49一样 将二级生物安全柜依照前窗操作口流入气流风速 排气方式和循环方式等分为4个类型 A1型 A2型 原B3型 B1型和B2型 12 二 对于安全柜的柜体结构 性能和测试方面 中国标准充分吸收了欧美标准的优点 采用的是两者中最严格的测试标准 13 对于柜体结构 EN12469和NSF49都是以规范性能为基础 不是通过细节规格要求去规定生产商如何制作安全柜 相反 生产商拥有很大的自由去设计自己的安全柜 只要能符合性能测试标准就可以 14 而中国的YY0569则明确规定了安全柜的柜体结构的设计标准 II级A2 B1 B2型安全柜的工作区均应该采用四面 左右两面 后部 底部 双层结构 三个类型安全柜的所有污染部位均应处于负压状态或被负压通道和负压通风系统包围 II III级安全柜裸露工作区内三面侧壁板应为一体成型结构 内表面的拼接处必须做密封处理等等 可以看出中国的YY0569标准相比欧美的标准更加明确规范了安全柜的柜体结构设计 更符合现在生物 化学等方面的实验要求 15 三 物理性能测试和合格标准YY0569 EN12469和NSF49都详细规定了安全柜的各项测试方法和合格标准 三者的区别和联系介绍如下 16 1 人员 试验品和环境保护的微生物挑战测试在对人员 产品和环境以及产品的防交叉污染保护项目测试中 三个标准的测试方法 合格标准基本相同 即用微生物挑战法来测试 但在人员保护测试中 中国的YY0569标准采用了同欧洲EN12469标准一样的 被认为是常规微生物挑战测试基础上更为方便快捷的物理测试方案 KI Discus测试 17 这种测试方法可以在1分钟内完成检测结果 远远低于微生物法的48小时以上的培养所需要的时间 这就使得安全柜的生产厂家对出厂前的每台安全柜都进行检测变成了可能 保证了每台出厂产品的安全性 远远优于采用微生物挑战法对产品抽检的厂家 18 2 下降气流流速测试下降气流流速对安全柜试验样品保护和交叉感染防护性能起到重要的影响 例如气流流速太小将导致试验样品失去保护 YY0569和EN12469都规定了二级安全柜下降气流流速的许可范围为0 25 0 5m s 而NSF49没有给出任何下降气流速率要求 19 在下降气流流速的测试方法上 YY0569则采用了和NSF49相似的方法 原理是一致的 YY0569和NSF49都规定了多个测试点 这代表更高的测量精度要求 其中YY0569使用的的热式风速仪 NSF49使用的是温差式风速仪 而EN12469则没有对测量仪器的准确度和类型进行规定 20 同时 YY0569和NSF49都通过规范有关测试仪器的精度和型号来提高测试的精度 并且YY0569还把安全柜的下降气流分为更细的均匀下降和非均匀下降两种模式 比NSF49的要求又提高一步 这说明在气流流速侧测试方面YY0569要优于美国的NSF49 更优于欧洲的EN12469标准 21 3 流入气流流速测试在流入气流测试方面 YY0569采用的标准同欧标EN12469一样 通过外排气流估算流入气流流速 美国标准采用的是直接流入气流流速测试方法 这两种方法测试的原理虽然不同但结果一样 同时YY0569 EN12469和NSF49都对最低流入气流流速有规定 在这里我们比较A2型二级生物安全柜和欧洲 普通型 二级生物安全柜的要求 YY0569和NSF49对A2型二级生物安全柜的最低流入气流速率的要求是0 5m s 而EN12469对二级安全柜的要求是0 4m s 22 4 工作舒适度有关标准 噪音 光强和震动测试在这几个方面测试上YY0569 NSF49和EN12469有类似的测试方法 这里就不再讨论 23 5 高效过滤器完整性测试YY0569 2005和NSF49都规定过滤器完整性测试中使用的是气溶胶喷发剂 例如DOP PAO等 欧洲EN12469标准 使用一样的测试方法 使用另一种自然气溶胶 自然空气 的测试方法 大量的研究表明使用自然气溶胶测试方法不能确保检测到所有漏隙 因为使用气溶胶发生器喷发产生的气溶胶颗粒 在发生器压力的作用下能很容易的抵达和扩散到安全柜内任何规定的位置 并且能使气溶胶均匀分布在柜内规定的位置 特别是能完全覆盖到高效过滤器和柜体结合的部位 24 而靠自然空气使气溶胶在柜内扩散的方法 由于柜内自然空气比较稳定 流动性和动力很差 所以气溶胶不会很均匀的扩散到柜内规定的部位 从而就可能有过滤器和柜体结合的部位没有被气溶胶完全覆盖的可能导致测试结果不精确 25 6 柜体泄漏的测试方法在柜体泄漏的测试方法上 YY0569采用了不同于欧美两个标准的压力衰减法 这个方法用到了压力计或压力传感器系统来显示柜内压力 可以定量的检测安全柜柜体的密闭性 非常具有说服力 而NSF49规定用简单的皂泡法泄漏测试为生产商对所有安全柜的例行检测 EN12469规定为独立的认证实验室的检测项目 而不是要求厂家在出厂时进行检测 26 7 其他各类测试在其他各个类型性能测试上 这三个标准基本采用了相同的测试方法 如马达和风机性能测试 工作区温升测试 柜体稳定性测试 包括柜体抗翻倒 柜体抗变形 工作台面抗变形 柜体抗向前倾倒 等 这里就不在过多的描述 27 结论尽管这三种标准的实施时间和内容不尽相同 但是在大体上拥有很大的相似性 在一些关键测试方法上 中国的标准在吸收了欧美标准中最佳方法的基础上 又开发了更精确严密的测试方法 所以说中国安全柜检测标准是目前世界上最严格的标准 正确的选择生物安全柜 并且按照操作守则正确使用 维护安全柜是确保实验室生物安全的基本原则 28 第三节净化工作台和生物安全柜的差别 是两个不同的概念不能以净化工作台代替生物安全柜 反之则可 保护对象不同 29 净化工作台类型 水平层流垂直层流 30 水平层流的 洁净台 原理图 31 一 水平层流的 洁净台 水平层流的洁净台不是生物安全柜 他们通过工作表面排放HEPA高效过滤的空气并直接吹向操作者 这些设备仅仅提供产品保护 他们可以用于某些洁净的工作 诸如无菌设备或电子设备的无尘组装 当处理细胞培养材料或药物合成时或当操作可能传染的材料时 这些洁净台是绝对不能使用的 操作人员在使用洁净台操作这些材料时 包括蛋白抗原 可能暴露于这些材料中 它可能导致过敏 水平层流的洁净台决不能代替生物安全柜用在生物医学或兽医实验室 32 垂直层流 洁净台 原理图 33 二 垂直层流 洁净台 垂直层流的洁净台同样不是生物安全柜 微生物实验室中使用 例如细胞培养时的无菌操作需要一个洁净的区域 由于这些设备一般有一个观察窗 空气通常从观察窗下排放到房间 它和水平层流的洁净台一样会导致同样的潜在危险 34 三 生物安全柜 BSCs 提供人员 环境和产品的保护 35 HEPA高效空气过滤器关键 HEPA过滤器清除粒子等于和大于0 3um粒子 这个粒径基本上包括了所有的细菌 孢子和病毒 的效率为99 999 典型的HEPA过滤器的介质是单层的硼硅酸盐纤维 摺皱的滤材又用铝盖板分开 滤材被粘合到木头 金属或塑料框架上 粗心的处理滤器 例如 不合适的储藏或摔落 能损坏粘接的滤材 或者造成漏洞或破裂导致破漏这就是安全柜在初次安装和重新移位后必须进行滤器整体检验的原因 36 一 生物安全柜的分型 ClassI级生物安全柜ClassII级生物安全柜 其又具体分为 1 ClassIITypeA1型生物安全柜2 ClassIITypeA2型生物安全柜3 ClassIITypeB1型生物安全柜4 ClassIITypeB2型生物安全柜ClassIII级生物安全柜 37 生物安全柜的选择及适用性表1通过危害评估选择生物安全柜 38 I级生物安全柜 样品没有得到保护操作者得到保护操作环境得到保护经过样品区的空气 经过高效过滤器的过滤之后 100 地排放到实验室环境中用途 在许多情况下 I级生物安全柜被用作特殊的密封设备 例如 离心 收获设备或小的发酵设备 或可能产生气溶胶的操作过程 例如倒笼子的垃圾 通气培养或组织搅拌 相当于安全通风柜 39 A前窗操作口B观察窗C排气过滤器D负压排气系统 腔体产生乱流 图1 级安全柜结构和气流模式示意图 40 I级生物安全柜改进型 反向的水平层流气体流速 0 4m sYY0569 2005 0 7 1 0m s 41 有前窗操作口的安全柜 操作者可以通过前窗操作口在安全柜内进行操作 操作口流入气流保护人员高效过滤器过滤的下降气流保护产品被污染气流经高效过滤器过滤后排出保护环境 级安全柜 42 级安全柜的分类 级安全柜根据结构特点和气流模式的不同分为A1 A2 B1 B2四种类型 43 级A1型安全柜 前窗操作口流入气流的最低速率为 0 40m s 下降气流为安全柜的部分流入气流和部分下降气流的混合气体 经过高效过滤器过滤后送至工作区 70 气体循环使用 30 排到室内或室外 44 级A1型安全柜 污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室或经安全柜的外排接口通过排风管道 软连接 排到大气中 安全柜内的污染部位可以处于正压状态 且这些正压区域可以没有负压区域包围 A1型安全柜不能用于挥发性有毒化学品和挥发性放射性核素的实验 45 A前窗操作口B观察窗C排气过滤器D下降气流过滤器E压力排气系统F风机图2 级A1型安全柜结构和气流模式示意图 侧视图 46 级A2型安全柜 操作口流入气流的最低速率为 0 50m s 下降气流为部分流入气流和部分下降气流的混合 经过高效过滤器过滤后送至工作区 污染气流经过高效过滤器过滤后可以排到实验室或经安全柜的外排接口通过排风管道 软连接 排到大气中 气流70 循环使用 30 外排 47 级A2型安全柜 安全柜内所有污染部位均处于负压状态或者被负压通道和负压通风系统环绕 安全柜用于进行以微量挥发性有毒化学品和痕量放射性核素为辅助剂的微生物实验时 必须连接功能合适的排气罩 48 A前窗操作口B观察窗C排气过滤器D下降气流过滤器E压力排气系统F风机图3 级A2型安全柜结构和气流模式示意图 49 级B1型安全柜 操作口流入气流的最低平均速率为 0 5气流循环提供 经过高效过滤器过滤后送至工作区 大部分被污染的下降气流经过高效过滤器过滤后通过专用的排气管道 硬连接 排入大气中 70 气流经过滤后外排 要求排到室外 需要70 外界空气补充30 气流经过滤后循环使用 50 级B1型安全柜 安全柜内所有被污染部位均处于负压状态或者被负压通道和负压通风系统包围 如果挥发性有毒化学品或放射性核素随空气循环不影响实验操作或实验在安全柜的直接排气区域进行 B1型安全柜可以用于以微量挥发性有毒化学品和痕量放射性核素为辅助剂的微生物实验 51 B观察窗C排气过滤器D下降气流过滤器E负压排气系统F风机G下降气流过滤器图4 级B1型安全柜结构和气流模式示意图 52 级B2型安全柜 全排式 前窗操作口流入气流的最低平均速率为 0 50m s 下降气流来自经过高效过滤器过滤的实验室或室外空气 即安全柜排出的气体不再循环使用 流入气流和下降气流经过高效过滤器过滤后通过专用排气管道 硬连接 排到大气中 不允许回到安全柜和实验室中 100 气流经过滤后外排进入环境100 外界空气补充无循环使用的气流 53 级B2型安全柜 所有污染部位均处于负压状态或者被直接排气 不在工作区循环 的负压通道和负压通风系统包围 B2型安全柜可以用于以挥发性有毒化学品和放射性核素为辅助剂的微生物实验 适用于生物安全危害程度1 2 3级的样品 54 A前窗操作口B观察窗C排气过滤器D下降气流过滤器E负压排气系统F风机G散流气图5 级B2型安全柜结构和气流模式示意图 55 ClassII级生物安全柜 A B3型 样品得到保护操作者得到保护操作环境得到保护气流经过过滤 从操作区顶部 由上往下 垂直地流向操作台面单向气流减少工作区内气流的扰动并且使交叉污染的可能性降到最小 30 气流经过滤后外排进入环境30 外界空气补充70 气流经过滤后循环使用允许有微量挥发性有毒化学物质及痕量的挥发性放射核素适用于生物安全1 2 3级样品 56 III级生物安全柜 全排封闭式 样品得到保护操作者得到保护 操作时戴全密封手套 操作环境得到保护气流经过过滤 从操作区顶部 由上往下 垂直地流向操作台面100 气流经过滤后外排进入环境100 外界空气补充无循环使用的气流风速 0 7m s 57 III级生物安全柜 III级生物安全柜是为操作4级生物安全水平的微生物病原体而设计的 对环境和操作者提供最大的保护 它是一个没有开放式观察窗的气密性的结构 长臂耐磨的橡胶手套以一种气密性的方式安装到安全柜的袖套孔上 可以在与内部隔离的条件下对柜内的材料进行操作 防止操作者与这些危险的材料直接接触 III级安全柜通常只是在最高围护功能的实验室内安装 这些实验室具有控制出入和特殊通风要求或其它支持系统 例如高压蒸汽 58 第四节生物安全柜的使用 59 一 操作程序 60 一 II级生物安全柜内的准备工作 在开始工作之前 准备一张特别的活动所需的材料检查清单 在生物安全柜内的放置必要的材料 因为安全柜的气幕防护屏障是很脆弱的 做好充分的准备是为了在正式工作时减少手臂穿越气幕的运动次数 操作者手臂横向快速地进出安全柜会干扰气幕 并损害安全柜所提供的局部防护屏障 手臂垂直于安全柜的操作口 进出时缓慢的移动 将减少这种危险 房间其他人员的活动 例如 迅速运动 开 关房间门等 也同样可以干扰安全柜的空气保护屏障 61 在开始工作之前 操作者应该调整凳子高度 使自己的脸在前操作口之上 在手臂放进安全柜内大约一分钟之后 才能进行实验操作 这样可以使安全柜稳定 并且能让气流 清扫 掉手和臂表面的微生物污染物 当操作者的胳膊横放在前面的格栅上的时候 房间空气可能直接流动到安全柜的工作区域 而不是通过前面的格栅进风 轻微地提高胳膊会缓和这个问题 前面的格栅绝对不能让研究记录 废弃的塑料包装和吸液装置等阻挡 所有的操作应该在距离前面的格栅4英寸里面的工作面上进行 62 二 工作前的净化 在开始工作之前要让安全柜的风机至少运行3 5分钟使安全柜内的空气进行净化 安全柜的工作台面 内壁 不包括送风滤器扩散板 和观察窗的内表面用消毒剂擦拭 再用无菌蒸馏水进行擦拭以清除残余的消毒剂 放到安全柜的容器和材料的表面应该以70 的乙醇擦拭 以减少将环境的杂菌带到安全柜内 定期的对孵箱和冰箱进行消毒 63 三 生物安全柜内部材料的放置 在安全柜的工作台面上可以放一块塑料衬底的能吸水的毛巾 所有的材料应该放在离安全柜前面的格栅和后面工作台面的边缘尽可能远的位置 图11 容易产生气溶胶的设备 例如 旋转搅拌器 台式离心机 应该靠近安全柜的后部放置 操作时的动作应该从工作台面的清洁区到污染区 64 65 安全柜内材料的放置 洁净培养物 左边 可以进行接种 中心 用过的污染吸管放在浅的平底盘里 而其它污染的材料可以放在生物危害包 右边 中 这安排对于习惯于左手操作的人要颠倒过来 洁净 污染 66 四 II级生物安全柜内的操作 在生物安全柜内所进行的许多普通过程可能产生喷溅或气溶胶 应该始终采用良好的微生物学技术 减少喷溅和气溶胶产生 II级生物安全柜的设计可以使水平方向喷出的孢子在14英寸的传播距离以内被安全柜向下流动的气流所俘获 因此 保持干净的材料离开产生气溶胶的活动至少1英尺以外将会减少交叉污染的可能性 67 68 69 70 五 消毒 表面消毒工作完成时 所有的容器和设备应该进行表面消毒并拿出安全柜 在每天工作结束时 应该对安全柜进行最后的表面消毒 包括工作台面 安全柜的边壁 后壁和观察窗玻璃内部的擦拭 如果必要 安全柜也应该进行放射性检测并进行必要的消毒 作为安全的微生物学操作的最后步骤 操作者应该摘下手套 脱下工作服并且洗手 71 72 六 发生少量的喷洒时的消毒 在生物安全柜内发生少量的喷洒时 应该用污染清除吸收纸巾立即进行处理 并将使用过的纸巾放到这个生物危害包里 对安全柜内的所有物品和安全柜内部 用浸满消毒液的毛巾立即进行擦洗 73 74 七 发生大量的溢出 当发生大量的溢出时 液体会通过前面或后部的格栅流到下面去 这时要求更广泛的消毒 安全柜内的所有的物品应该进行表面消毒并拿出安全柜 应该使消毒液维持20 30分钟的适当接触时间如果溢出的液体含有放射性材料 可采取类似的程序 并应该与辐射安全人员联系 寻求特殊的指导 75 八 气体消毒 在更换HEPA过滤器或进行内部维修之前 要对生物安全柜必须进行消毒 76 第五节生物安全柜检测 根据中华人民共和国卫生行业标准 WS233 2002 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则的相关规定 有下列情况之一时 必须对 级生物安全柜进行现场检测 1 实验室施工时 级生物安全柜搬放到指定位置后 2 级生物安全柜被移动位置后 3 对 级生物安全柜进行检修后 4 级生物安全柜更换高效过滤器后 5 级生物安全柜一年一度的常规现场检测 77 一 现场检测的必测项目和方法 垂直气流速度断面测定仪器 准确度为读数 3 的热风速计 方法 测点位于柜内送风口下方0 15m处 为均匀测点 测点间距不大于0 15m 测点布置不少于三行 靠内壁的行距柜内壁0 15m 每行不少于7个测点 判定 垂直气流均匀区所测平均风速与生产厂给定值之差小于 0 025m s 且单点风速与所测平均风速之差不大于20 为合格 78 二 工作窗口进风风速测定 方法 首先测定工作窗口进风风量 再除以生物安全柜工作窗口面积计算出进风风速 工作窗口进风风量通过测定生物安全柜的排风风量而求出 对于仅从工作窗口进风的生物安全柜 生物安全柜的排风风量就等于工作窗口进风风量 对于除从工作窗口进风外 还有单独的进风管的生物安全柜 则从排风管的总排风量扣除进风管进风风量即为工作窗口进风风量 采用JGJ7l 1990中所规定方法测定生物安全柜的 进 排风管风量 判定 所测进风风速与生产厂给定值之差小于 0 025m s为合格 79 三 烟雾试验 使用发烟物作直观判断 在工作表面中线上方高于工作窗口上沿0 15m处从侧板一端到另一端发烟 应为垂直流线 不得有死