基因工程所需的基本条本.ppt

第三章基因工程的基本条件 基本条件 用于核酸操作的工具酶用于基因克隆的载体用于基因转移的受体菌或细胞 基因工程操作过程 基因工程的操作 是在分子水平上的操作 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶 连接酶 DNA聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割 拼接和扩增等操作 所以把这些酶称之为 工具酶 一类来源于原核生物的 能够识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列 回文序列 4 8bp 并切割DNA双链 使磷酸二酯键断开的核酸内切酶 1 定义 第一节限制性核酸内切酶 Restrictionendonuclease II型限制性内切酶 同型二聚体结构与DNA双链结合 两个催化Mg2 与DNA裂解位点相邻 限制性内切酶EcoRI的结构 2 修饰 Modification 细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护 不能被自身的限制性内切酶识别切割 2 细菌的限制和修饰系统 R M体系 1 限制 Restriction 限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断 研究发现 限制 修饰系统广泛存在在原核细菌中 与三个连锁基因相关 Genesforrestriction modificationenzymesareoftenclusteredtogetherinaregioncalledan immigrationcontrolregion TheimmigrationislandfromE coliK 12isabout14Kbp 噬菌体DNA进入细菌后 其基因组DNA被降解 3 类型分类的主要依据 亚单位组成识别序列的种类是否需要辅助因子分三类 I II III 1 酶结构三亚基 包括 R 限制酶亚基 M 甲基化酶亚基 S 识别DNA序列亚基 2 切割位点切割位点在识别位点1000bp以外 无特异性 4 I型限制性内切酶首先由M Meselson和R Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离的 如EcoB和EcoK 研究较少 Recognizesite cut 1 1 5kb 3 结合方式I类限制性内切酶与DNA结合依赖M亚基与辅助因子S 腺苷甲硫氨酸 SAM 的相互作用 例子 EcoB的识别序列为T G A N8 T G C TA C T N8 A C G AEcoK的识别序列为A A C N8 G T G CT T G N8 C A C G II类限制性内切酶 93 II类限制性内切酶由H O Smith等1970年首先在流感嗜血杆菌Rd型菌株中发现 目前已有3000多种II类限制性内切酶被分离 它是分子量较小的单体蛋白 识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg2 识别和切割位点的序列有严格的特异性 1 酶结构修饰和限制活性由分开的两个酶 甲基化酶和限制性内切酶 来完成 其中甲基化酶由一条肽链构成 限制酶由相反方向结合的同源二聚体构成 2 识别序列DNA双链上的回文对称序列 旋转对称序列 反向重复序列 一般长4 8bp 与DNA的来源无关 EcoRI 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 EcoRV 3 切割位点 识别位点处切开双链DNA 形成粘性末端 stickyend 或平末端 bluntend 几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点 4 粘性末端 stickyends cohensiveends 含有几个核苷酸单链的末端 分两种类型 5 端凸出 如EcoRI切点 G AATTC CTTAAG GAATTC CTTAA G 5 3 3 5 5 3 3 5 EcoRI等产生的5 粘性末端 EcoRI37 退火4 7 5 G C T GA A T T C G A G 3 3 C G A C T T A AG C T C 5 OH P OH P PstI等产生的3 粘性末端 5 G C T C T G C A G G A G 3 3 C G A G A C G T C C T C 5 PstI37 5 G C T C T G C A OHP G G A G 3 3 C G A G POH A C G T C C T C 5 退火4 7 5 G C T C T G C AG G A G 3 3 C G A GA C G T C C T C 5 OH P OH P PvuII等产生的平头末端 5 G C T C A G C T G G A G 3 3 C G A G T C G A C C T C 5 PvuII37 粘性末端促进连接便利 i 不同的DNA双链 只要粘性末端碱基互补就可以连接 ii 同一个DNA分子内连接 通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子 识别相同序列的限制性内切酶称同裂酶 5 同裂酶 Isoschizomers 同序同切酶 完全同裂酶 识别位点和切点完全相同 如Hind 和HsuI Hind 5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 HsuI5 A AGCTT 3 3 TTCGA A 5 识别位点相同 但切点不同 如XmaI和SmaI 同序异切酶 不完全同裂酶 XmaI5 C CCGGG 3 3 GGGCC C 5 SmaI5 CCC GGG 3 3 GGG CCC 5 识别的序列不同 但能切出相同的粘性末端的酶 如BamHI Bgl BclI Xho 等 6 同尾酶 Isocaudamers 5 G GATCC 3 3 CCTAG G 5 BamHI BclI 5 T GATCA 3 3 ACTAG T 5 5 A GATCT 3 3 TCTAG A 5 Bgl 5 U GATCY 3 3 YCTAG U 5 Xho U代表嘌呤 Y代表嘧啶 5 GATC 3 3 CTAG 5 Sau3A 同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别 5 G3 CCTAG GATCT 3 A 5 BamHI Bgl 5 GGATCT 3 3 CCTAGA 5 BamHI Bgl Sau3A 7 DNA末端长度对限制酶切割的影响 8 酶切反应条件 缓冲液 MgCl2 NaCl KCl 提供Mg2 和离子强度Tris HCl 维持pH 二硫苏糖醇 DTT 保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA等 有助于酶的稳定 反应温度 大多数为37 反应时间 通常1h 许多酶延长反应时间可减少酶量 终止酶切的方法 a 10mM LEDTAb 加热 大多数酶可用65 温育20分钟失活C 苯酚抽提蛋白 然后用乙醇沉淀DNA 一个酶单位 U 指 在理想的反应条件 适宜的缓冲液和反应温度 通常为37 下 50 L反应体系中完全降解1 g DNA所需要的酶量 影响酶活性的因素很多 最重要的有 ADNA的纯度和甲基化程度B甘油的含量 不超过5 C反应体系中的离子强度D反应体系的pH值F反应的温度条件 通常为37 Buffer 10X 2 0 LWater16 5 LDNA1 0 LEnzyme0 5 LVolume20 0 L 酶单位的定义和影响酶活性的因素 酶切反应的基本步骤 电泳 紫外分析 37 1h 加反应液 CK M 1 0kb 1 0kb 0 4kb 0 5kb 0 6kb CK M T T 酶量的确定 2 3倍才能保证完全消化 10 双酶切反应1 对盐浓度要求相同的酶 原则上可以同时酶切2 对盐浓度要求不同的酶 也可采取同步双酶切 选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步 3 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液 就只能采用分步酶切 分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始 酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求 然后加入第二种酶完成双酶切反应 3 III类限制性内切酶 1 由R亚基和MS亚基二亚基组成双功能酶 其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性 在切割位点下游24 26bp处 反应需要ATP Mg2 和SAM S 腺苷蛋氨酸 该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP 修饰作用和切割作用取决于两个亚基之间的竞争 修饰作用在识别位点内进行 切割序列位于识别位点一侧若干碱基对处 无序列特异性 在基因工程操作中用途不大 EcoP15I M EcoP15I 1973年H OSmith和D Nathans提议的命名系统 命名原则如下 三 限制性内切酶的命名 1 用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名 大肠杆菌 Escherichiacoli 用Eco表示 流感嗜血菌 Haemophilusinfluenzae 用Hin表示 2 用一个大写字母表示菌株或型 如Ecok EcoR 3 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统 用罗马字母表示 如EcoRI EcoRV 限制性核酸内切酶的命名 四 影响限制性内切酶活性的因素 DNA的纯度DNA中的杂质如蛋白质 酚 氯仿 乙醇 SDS EDTA等都会影响酶的活性 一般采取 纯化DNA 如用2 5倍体积的冰冷乙醇沉淀 加大酶的用量 延长保温时间 扩大反应体积 20 l 2 DNA的甲基化程度大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒 dam甲基化酶 修饰GATC中的A dcm甲基化酶 修饰CCA TGG的C 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株 3 温度不同的限制性内切酶的最适反应温度不同 大多数是37oC 少数要求40 65oC 4 缓冲液 Buffer 是影响限制酶活性的重要因素 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液 缓冲液的化学组成MgCl2 NaCl KCl 提供Mg2 和离子强度 Tris HCl 维持pH 二硫苏糖醇 DTT 保持酶稳定性 牛血清白蛋白BSA等 有助于酶的稳定 第二节基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶2 Klenow片段3 T4噬菌体DNA聚合酶4 T7噬菌体DNA聚合酶5 反转录酶6 末端转移酶 共同特点把dNTPs连续地加到引物的3 OH端 2 主要区别持续合成能力和外切酶活性不同 如 T7DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来 常用的DNA聚合酶的特点 1 大肠杆菌DNA聚合酶I 1 大肠杆菌DNA聚合酶I DNAPolI 的性质 一条多肽单链 5 3 DNA聚合酶活性 5 3 外切酶活性 位于N端 用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5 3 外切酶活性部分 就成为Klenowfragment 3 5 外切酶活性 底物 dNTPs dATP dGTP dCTP dTTP Mg2 带有3 OH游离端的引物 DNA模板 2 DNA聚合酶I的反应条件 OH 5 3 dNTPs 5 G C T C A G C T G G A G T 3 3 C G A G T C G A C C T C A 5 5 G C T CA G C T G GA G T 3 3 C G A G T C G A C C T C A 5 5 G C T C A G C T G G A G T 3 3 C G A G T C G A C C T C A 5 3 DNA聚合酶I基本用途 制备32P标记的探针 DNAaseI DNAPolI Mg2 5 dNTP5 pppdA a 32P dATP DNAaseI 为一内切核酸酶 它优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链DNA 形成单链切口 2 Klenowfragment 1 Klenowfragment的性质具有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 失去了5 3 外切酶活性 DNAPolI Klenowfragment 76KD 枯草杆菌蛋白酶 3 端补平补平限制性内切酶切后形成的3 隐蔽端 5 5 klenow DNA3 末端标记在3 隐蔽端加上放射性标记的dNTP klenow 2 主要用途 3 隐蔽末端的DNA片断 Klenowfragment补平 根据末端的顺序选择一种 32P dNTPs 末端标记的DNA 限制性内切酶切 5 G3 3 CTTAA5 5 GAA3 3 CTTAA5 5 GAATT3 3 CTTAA5 5 G3 3 CCTAG5 5 GG3 3 CCTAG5 5 GGATC3 3 CCTAG5 EcoRI BamHI 32P dATP 32P dGTP 25oC1h 1 T4DNA聚合酶的性质从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化 有5 3 聚合酶活性和3 5 外切酶活性 约为Klenow片段活性的200倍 3 T4DNA聚合酶 用3 5 外切酶活性作用于末端制造出3 隐蔽端 再利用它的5 3 聚合酶活性补平 并加入放射性标记的dNTP 5 5 3 3 5 5 3 3 T4DNA聚合酶 无dNTPs T4DNA聚合酶 有dNTPs 5 5 当没有dNTP时 T4DNA聚合酶行使3 5 外切酶功能 制造出3 隐蔽端 当有dNTP时 T4DNA聚合酶行使5 3 聚合酶功能 填平3 隐蔽端 5 逆转录酶依赖RNA的DNA聚合酶 RNA指导的DNA聚合酶 来源于RNA肿瘤病毒 最普遍使用的是来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒 avianmyeloblastosisvirus AMV 作用 以oligodT为引物 与mRNA的polyA尾巴互补结合 合成cDNA AAAAA TTTTT 5 3 mRNA5 cDNA 不需要模板的DNA聚合酶 随机掺入dNTPs 5 p 3 HO OH3 p5 末端转移酶 Mg2 dATP 5 p 3 HO AAAAAAAAAAAAOH3 p5 6 末端转移酶来源于小牛胸腺 是一种不依赖于模板的DNA聚合酶 可在cDNA或载体的3 末端加同聚物尾巴 便于克隆 一 连接酶 1 两种DNA连接酶 1 大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端 2 T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端 还能连接齐平末端 2 连接条件 1 必须是两条双链DNA 2 DNA3 端有游离的 OH 5 端有一个磷酸基团 3 需要能量动物或噬菌体中 ATP大肠杆菌中 NAD 第三节其它分子克隆工具酶 OH P 3 功能 1 修复DNA链上切口处的磷酸二酯键 T4 DNA连接酶 5 G C U C U G C C G G A G 3 3 C G A GA C G G C C T C 5 nick 5 G C U C U G C C G G A G 3 3 C G A G A C G G C C T C 5 2 连接多个平头双链DNA分子 5 G C T C A G C T G G A G 3 3 C G A G T C G A C C T C 5 T4 DNA连接酶 4 连接反应的温度 最佳温度 连接酶反应的最佳温度是37 C 实用温度 在37 下粘性末端的结合很不稳定 所以一般采用4 16 C 插入片段与载体的浓度比例 10 20倍 摩尔之比 目的 增加插入片段与载体的接触机会 减少载体自我连接的现象 DNA连接酶 DNA连接酶的反应条件 Tris HCl 50 100mMpH7 5 MgCl2 10mM ATP 0 5 1mM DTT 5mM Volume 10 20ul 4 15 4 16hr 1UDNA连接酶的酶活性 在最佳反应条件下16 反应1小时 完全连接1mgl DNA HindIII片段 所需的酶量 二 碱性磷酸酶 1 碱性磷酸酶种类 从大肠杆菌中分离出来 具有抗热性 Bacterialalkalinephosphatase BAP 1 细菌性碱性磷酸酶 2 小牛肠碱性磷酸酶 Calfintestinalalkalinephosphatase CIP 从小牛肠中纯化出来 SDS中加热68oC可完全失活 2 碱性磷酸酶的特性 催化脱掉DNA 或RNA 5 端的磷酸根 3 P OH 5 3 HO P 5 5 3 HO OH 5 3 HO OH 碱性磷酸酶 3 碱性磷酸酶的功能 1 防止线性化的载体分子自我连接 单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接 AAGCTTTTCGAA Hind 酶切 A OHTTCGA P P AGCTTHO A 碱性磷酸酶 5 5 5 A OHTTCGA OH HO AGCTTHO A OH与OH不能形成磷酸二酯键 所以不能自我连接 但同一酶切后的外源DNA的5 端有P 能与脱磷酸的载体OH连接 ATTCGA AGCTTA AGCTT A A TTCGA 连接酶 OH与 OH连不住 其中每条链上都有一个nick 但转入细菌后会被修复 3 P AGCTT A OH 5 3 HO A TTCGA P 5 外源DNA 四 核酸酶 1 单链核酸外切酶 核酸外切酶VII ExoVII 大肠杆菌的核酸外切酶VII不需要Mg2 ExoVII 3 5 3 5 3 5 3 5 2 双链核酸外切酶 核酸外切酶III ExoIII 大肠杆菌的核酸外切酶III特异性地从3 端外切 ExoIII 3 5 3 5 Mg2 3 5 3 5 Exo 3 5 3 5 Mg2 3 双链核酸外切酶 核酸外切酶 Exo 核酸外切酶特异性地从5 端外切 3 5 3 5 4 单链核酸内切酶 S1核酸酶S1核酸酶的基本特性 来自稻谷曲霉菌 Aspergillusoryzae 降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍Zn2 必需最适pH范围为4 0 4 3需要NaCl10 300mM降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍 一 载体的功能及特征 1 定义 把目的基因通过运载工具送到受体细胞内 这种运载工具就叫载体 vector 2 载体的特征1 在宿主细胞内必须能够自主复制 具备复制起点 2 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点 供外源DNA片断插入 同时不影响复制3 有一定的选择标记 用于筛选 第四节用于基因克隆的载体 3 载体的种类质粒载体 plasmid 噬菌体载体 phage 动物病毒 virus 噬菌粒载体考斯质粒 cosmid 人造染色体 artificalchromosome 二 质粒载体 质粒 plasmid 独立于染色体以外的能自主复制的双链 共价 闭合 环状DNA分子 大小范围在1kb 200kb以上不等 质粒存在于细菌 霉菌 蓝藻 酵母等细胞中 细菌的大质粒可含几百个基因 小质粒仅含20 30个基因 致育质粒 F质粒 fertilityplasmid 编码有性生殖功能 带有F质粒的细菌为雄性菌 能长出性菌毛 无F质粒的细菌为雌性菌 无性菌毛 耐药性质粒编码细菌对抗菌药物或重金属盐类的耐药性 耐药性质粒分为二类 其中可以通过细菌间的接合进行传递的称接合性耐药质粒 又称R质粒 resistanceplasmid 另一类是不能通过接合传递的非接合性耐药质粒 但它可通过噬菌体传递 细菌粘附定植在肠粘膜表面是由K质粒决定的 细菌素质粒编码各种细菌产生细菌素 如Col质粒编码大肠杆菌素 对同品系或近缘的细菌具有抑制作用 实际是对产生细菌素细菌本身起保护作用 代谢质粒编码产生相关的代谢酶 如沙门菌发酵乳糖的能力通常是由质粒决定的 细菌携带有哪种质粒 则有相应的功能 但也有某种质粒可同时决定几种功能 如F质粒除有致育性功能外 还能提供辅助质粒转移的能力 某些耐药性质粒上还带有编码毒力的基因 故带此种质粒的细菌 不仅获得了耐药性 而且致病性也得到了增强 毒力质粒或Vi质粒 virulenceplasmid 编码与该菌致病性有关的毒力因子 天然质粒用作载体的局限性 局限性 分子量高 拷贝数低 合适的单一酶切位点少 选择标记不合适 1 质粒的空间构型 共价闭合环状DNA CovalentclosecircularDNA cccDNA 呈超螺旋 supercoil SC 开环DNA opencircular ocDNA 一条链上有一至数个缺口 线形DNA Linear LDNA DNA超螺旋结构 质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同 不同的构型电泳迁移率不同 scDNA最快 lDNA次之 ocDNA最慢 SC OC L 2 质粒的基本性质 1 质粒的自主复制性质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 根据在每个细胞中的分子数 拷贝数 多寡 质粒可分为两大复制类型 严紧型质粒 stringentplasmid 拷贝数少 大约有1 几个拷贝 松弛型质粒 relaxedplasmid 拷贝数多 有10 60份拷贝 2 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒 不能同时存在于一个细胞中 这种现象称为质粒的不相容性 不相容性的质粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例 ColE1 pMB1拥有相似的复制子结构 彼此不相容 pSC101 F RP4拥有相似的复制子结构 彼此不相容 质粒的不相容性分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒 在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节 致使两种质粒的最终拷贝数恒定 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内 两种含有相似复制子结构的不同质粒 在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰 由于竞争作用致使两种质粒的最终拷贝数不同 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势 质粒不亲和性 a 在同一个细胞中含有两种不相容的质粒 b 随着细胞的分裂质粒分配到两个子细胞中去 c 在下一次细胞分裂之前 质粒拷贝数加倍 但因为存在竞争 增加拷贝数不同 d 两种不相容质粒拷贝数比例发生变化 最终产生出只含有一种类型质粒的子细胞 在大肠杆菌中的质粒 可以分为 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞 接合作用 多为低拷贝的大质粒 含有完整的转移操纵子基因 tra 和转移起始位点 能在同种或亲缘关系近的菌体细胞间进行转移 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 多为高拷贝的小质粒 如大肠杆菌的ColE1 RSF1010等 由于缺少转移基因 tra 不能自主转移 但由于含有与F质粒类似的bom位点或诱动基因mob mobilization 因而能被带有tra基因的转移性质粒诱动而发生转移 3 质粒的转移性 大肠杆菌接合 conjunction F因子 又叫致育因子 在某些大肠杆菌中发现的一种最具代表性的单拷贝的接合型质粒 94kb 总共编码19个转移基因 tra 以三种形式存在 3 质粒上的标记基因野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因 这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状 但是对DNA重组分子的筛选具有重要意义包括 物质抗性 抗生素 重金属离子 毒性阴离子 有机物物质合成 细菌毒素 天然色素 有机碱 标记基因用途 1 选择标记基因 鉴别目的DNA 载体 的存在 将成功转化了载体的宿主挑选出来 2 筛选标记基因 用于将携带了外源DNA片断的重组子挑选出来 4 质粒的命名用小写字母p代表质粒 plasmid 在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称 再加上质粒编号 如 pBR322 p表示一种质粒 而 BR 则是分别取自该质粒的两位主要构建者F Bolivar和R L Rodriguez 322为编号 5 质粒载体的种类1 克隆质粒载体 cloningvector 主要用于扩增或保存DNA片断 其上有复制子 最好是松弛型高拷贝 2 表达质粒载体 expressionvector 能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体 这类载体既有复制子 更要有强启动子 3 穿梭质粒载体 shuttlevector 装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆 这类载体可以在原核细胞中复制 也可在真核细胞中扩增和表达 1 克隆质粒载体天然存在的野生型质粒由于分子量大 拷贝数低 单一酶切位点少 遗传标记不理想等缺陷 不能满足克隆载体的要求 因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的 pSC1018 8kb 拷贝数5 四环素抗性标记基因TetrColE16 5kb 拷贝数20 30 大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124ColE1衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因Ampr 组成 它由三部分组成 来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr 来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori 常用质粒克隆载体 pBR322 4376bp pBR322质粒载体的结构来源 特点 具有多个单一的限制性内切酶位点 Tetr中有BamH1切点 G GATCC 和Sal 切点 G AATTC Ampr中有Pst 切点 CTGCA G 利用ColEl的复制子 所以在细胞中是多拷贝的 重组克隆的 插入失活 筛选方法 外源基因 插入在Tetr中 基因型为TetsAmpr 外源基因 插入在Ampr中 基因型为TetrAmpr Tetr 在含有四环素培养基可生长 Tets 在含四环素培养基上不生长 Ampr 在含有氨卞青霉素培养基上不生长 Amps 在含有氨卞青霉素培养基上可生长 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型 这种在一个基因位点中插入外源DNA片段 从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活 insertionalinactivation pBR322质粒载体tetr基因插入失活效应 常用质粒克隆载体 pUC系列 pUC18 19特点 具有更小的分子量 2686bp 和更高的拷贝数 500 700个 具有多克隆位点 很方便插入外源基因含有氨苄青霉素抗性基因可用 互补方法鉴别 含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ 基因 b pUC18 19 正选择标记lacZ 的显色原理 5 溴 4 氯 3 吲哚基 b D 半乳糖苷 X gal 半乳糖苷酶的 肽段 lacZ MCS Plac 突变型lac E coli 溴氯吲哚 LacZ 大肠杆菌的编码 半乳糖苷酶基因 编码1024个氨基酸 切断乳糖的半乳糖苷键产生半乳糖和葡萄糖LacZ 编码 半乳糖苷酶N端146个氨基酸 这个编码区中插入了一个MCS 但它并不破坏读框 但是 若在该DNA小片段中再插入一个片段 将几乎不可避免地导致产生无 互补能力的 半乳糖苷酶片段X gal 5 溴 4 氯 3 吲哚基 b D 半乳糖苷 也是 半乳糖苷酶的一种生色底物 经降解后可生成溴氯吲哚 呈蓝色 也使大肠杆菌菌落从白色转变为蓝色 互补 Alphacomplementation 质粒中插入lacZ 基因 编码N端146个氨基酸残基 半乳糖苷酶的 片段 突变型lac E coli可表达该酶的 片段 酶的C端 单独存在的 及 片段均无 半乳糖苷酶活性 只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时 宿主细胞内才有 半乳糖苷酶活性 使底物X gal特异性变为蓝色化合物 这就是所谓的 互补 BlueWhite 2 表达质粒1 大肠杆菌中的表达质粒包括启动子 操纵位点序列 多克隆位点 转录及翻译信号 质粒复制起点及筛选标记等2 真核表达质粒酵母表达质粒昆虫表达质粒哺乳动物细胞表达质粒 1 大肠杆菌中的表达质粒 启动子 promoter 是与基因表达启动相关的顺式作用元件 与RNA聚合酶特异结合 是基因转录的起始部位 分为两类 一类是RNA聚合酶能够直接识别的 另一类在与RNA聚合酶结合时需要蛋白质辅助因子存在 序列特点 上游有 10 共同序列TATAAT Pribnowbox 上游有 35 共同序列TTGACA Lac启动子 Plac 中等强度启动子 一般带有lacZ 基因片段 实现 互补 噬菌体左臂 PL 和右臂启动子 PR 是 噬菌体早期左臂和右臂转录控制区 启动效率高 广泛使用的原核生物启动子 Trp启动子 Ptrp 是强启动子 来源于大肠杆菌色氨酸操纵子 在富含trp的培养基中处于关闭状态 当trp水平下降 Ptrp开始转录 T7启动子 PT7 来自于T7噬菌体晚期转录基因启动子 只能由T7聚合酶识别 其转录活性是大肠杆菌聚合酶6倍 因此PT7转录活性高 lac操纵元结构 调节序列 结构基因 操纵子 以乳糖操纵子为例来说明 异丙基硫代半乳糖苷 isopropylthiogalactoside IPTG 就是其中一种很强的诱导剂 不被细胞代谢而十分稳定 核糖体结合位点 ribosomebindingsite RBS 大肠杆菌中翻译起始时 首先是核糖体30S小亚基识别并结合至mRNA5 端的翻译起始部位 该部位就是RBS RBS包括起始密码子ATG序列及其上游SD序列 SD序列 ATG上游3 11碱基处的保守序列AGGAG 可与小亚基中16SrRNA3 端富含嘧啶序列互补结合 mRNA必须有这一序列才能进入核糖体 转录终止区 terminator 是DNA分子中决定RNA聚合酶终止转录的一段回文核苷酸序列 分为两类 不依赖 因子的终止子的回文序列中富含GC碱基对 在回文序列的下游方向又常有6 8个AT碱基对 而依赖 因子终止子中回文序列的GC对含量较少 在回文序列下游方向的序列没有固定特征 其AT对含量比前一种终止子低 大肠杆菌中蛋白表达形式 1 完整目的蛋白 2 融合蛋白 两个或多个基因的开放阅读框按一定顺序连接在一起表达形成的蛋白 当蛋白质表达以后 有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素 通过以融合蛋白的形式表达 并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化 用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽 Tag 常用的有谷胱甘肽转移酶 glutathioneS transferase GST 六聚组氨酸肽 polyHis 6 6 Histag 金黄色葡萄球菌蛋白质A或G proteinA proteinG 等 融合蛋白的表达载体 1 GST融合表达载体GST是来源于血吸虫的小分子酶 26kDa 在E coli易表达 在融合蛋白状态下保持酶学活性 对谷胱甘肽有很强的结合能力 GST表达载体在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列 其一是谷胱甘肽转移酶基因 其二是凝血蛋白酶 Thrombin 切割位点的编码序列 当外源基因插入到多克隆位点后 可表达出由三部分序列组成的融合蛋白 将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱 当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱时 融合蛋白将吸附在树脂内 其它细胞蛋白就被洗脱出来 然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的缓冲液洗脱 可将融合蛋白释放出来 再用凝血蛋白酶切割融合蛋白 便可获得纯化的目标蛋白 除了凝血蛋白酶的切割位点外 其它还有肠激酶 2 his 组氨酸 标签表达载体 启动子下游有一段编码6个组氨酸的序列 多聚组氨酸肽能与2价金属离子结合 镍离子 将镍离子固定在树脂上 便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离 真核表达载体酵母表达载体昆虫表达载体哺乳动物细胞表达载体 酵母表达载体酿酒酵母和毕赤酵母毕赤酵母载体 均为大肠杆菌 毕赤酵母穿梭载体 毕赤酵母启动子 来自乙醇氧化酶基因AOX1 受到甲醇严格控制 哺乳动物细胞表达质粒载体包括 1 大肠杆菌的复制子及抗生素抗性基因 便于基因工程操作2 哺乳动物的启动子和增强子 使外源基因表达3 含有终止信号及加polyA信号 polyA上游11 30bp处有一高度保守的AAUAAA序列 下游富含GU或U Neomycin G418 绿色荧光蛋白 greenfluorescenceprotein GFP 从水母体内发现的发光蛋白 分子质量为26kDa 由238个氨基酸构成 第65 67位氨基酸 Ser Tyr Gly 形成发光团 是主要发光的位置 其发光团的形成不具物种专一性 发出荧光稳定 且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光 绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定 对多数宿主的生理无影响 是常用的报道基因 如利用GFP的示踪特性 研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系 即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制 内部核糖体进入位点序列 Internalribosomeentrysite IRES IRES能招募核糖体对mRNA进行独立地翻译 3 穿梭质粒穿梭载体 Shuttlevector 是能够在两类不同宿主中复制 增殖和选择的载体 这类载体可以在原核细胞中复制 也可在真核细胞中扩增和表达 酵母 昆虫 哺乳动物细胞等使用的表达载体 一般都有在大肠杆菌中复制的元件 因此都具备穿梭载体的特征 如大肠杆菌 酵母 大肠杆菌 昆虫细胞 大肠杆菌 哺乳动物细胞穿梭载体等 5 质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列2种方法制备质粒DNA 1 氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高 周期长 设备要求高 溴乙锭污染2 碱裂解法方便 快速 满足一般需要 1 氯化铯密度梯度离心法 原理 是一种沉降平衡离心法 经超速离心 离心介质CsCl形成一连续的密度梯度 在过量EB存在的条件下 各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开 其中蛋白质密度小 1 3g cm3 1 4g cm3 浮于液面 RNA密度大 2 0g cm3 沉于管底 各种DNA密度介于蛋白质与RNA之间 处于中部 过量EB处理前 细菌染色体DNA与不同分子构型的质粒DNA的密度均为1 7g cm3左右 难以区分 经过量EB处理后 不同分子构型的DNA与EB的结合能力不一样 因而密度下降不一致 可有效分离 其中 闭环质粒DNA为超螺旋三级结构 EB不易插入 结合量少 密度下降小 约为1 59g cm3 而染色体DNA 开环质粒DNA以及带切口的环状质粒DNA可以嵌入更多的EB 密度下降较多 约为1 54g cm3 从而能与闭环质粒DNA分开 proteins ocDNA L DNA cccDNA RNAs 过程 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNA 2 碱变性法原理 碱变性法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异 在pH12 0 12 6碱性环境中 线性的大分子量细菌染色体DNA变性 而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将pH调至中性并有高浓度盐存在的条件下 染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构 大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀 而质粒DNA仍为可溶状态 通过离心可除去大部分细胞碎片 染色体DNA RNA及蛋白质 质粒DNA尚在上清中 再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 由于操作原因 提取的质粒可有三种结构 线形 开环 闭环超螺旋 试剂1 LB培养基2 溶液I3 溶液 4 溶液III5 TE pH8 0 稳定 LB培养基配制1升培养基 应在950ml去离子水中加入 细菌培养基用胰化蛋白胨 bacto tryptone 10g细菌培养基用酵母提取物 bacto yeastextract 5gNaCl10g摇动容器直至溶质完全溶解 5mol LNaOH 约0 2ml 调节pH值至7 0 加入去离子水至总体积为1L 15lbf in2 1 034 105Pa 高压下蒸汽灭菌20分钟 溶液I50mmol L葡萄糖25mmol LTris Cl pH8 0 10mmol LEDTA pH8 0 在10lbf in2 6 895 104Pa 高压下蒸汽灭菌15分钟 保存于4 作用 分散细胞 鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II0 2mol LNaOH 从5mol L贮存液中现用稀释 1 SDS作用 细胞壁肽聚糖在碱性下水解 核酸和蛋白质变性 溶液III5mol L乙酸钾冰乙酸水作用 酸性条件下质粒DNA复性 变性蛋白 SDS使线性DNA 蛋白沉淀 培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌接种到1 5 3ml含有相应抗生素的液体培养基 37 培养12 16小时 取液体培养液1 5 3ml于Eppendorf管中 10000r min离心1min 去掉上清液 加入100 l溶液1 充分混匀放置3 5分钟 加入200 l新配制的0 2mol LNaOH 1 SDS 溶液II 加盖颠倒6 7次使之混匀 质粒小量提取的方法 手工提取 加入150 l溶液III 加盖后颠倒6 7次混匀 放置5min 用台式高速离心机 10000r min离心7min 上清移入另一干净离心管 并加1ml100 乙醇混匀 12000r min离心5min 弃去上清液 沉淀用0 5ml70 乙醇清洗一次 12000r min离心5min 弃去上清液 小管倒置于吸水纸上 除尽乙醇 室温自然干燥 加入30 50 l含有20 g mlRNase的灭菌蒸馏水或TE缓冲液溶解提取物 室温放置15 30min 使DNA充分溶解 有时需要酚 氯仿抽提 将分离出的质粒DNA置于 20 保存备用 1 噬菌体的生物学特性 三 噬菌体载体 有尾部结构的二十面体 噬菌体由外壳包装蛋白和DNA组成 裂解周期和溶原周期 2 噬菌体的生活周期 裂解周期 E coliT4噬菌体的生命周期 以分钟记 t 0噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁 大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入 t 1寄主DNA RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭 t 2第一个噬菌体mRNA开始合成 t 3细菌DNA开始降解 t 5噬菌体DNA合成开始启动 t 9 晚期 噬菌体mRNA开始合成 t 12出现完整的头部和尾部结构 t 15出现头一个完整的噬菌体颗粒 t 22细菌发生溶菌作用 释放出约300个左右的噬菌体时粒 溶原周期 噬菌体感染大肠杆菌后 通过同源重组 将其DNA整合到宿主细胞的染色体DNA上 并不产生子代噬菌体颗粒 这种状态称为溶原状态 这个过程称溶原化 整合主要由 DNA上的c 和int两基因的产物所激活 原噬菌体 prophage 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体 随细菌的染色体复制而复制 3 噬菌体的基因组 1 线状双链DNA分子 全长48 502bp 2 两端的5 末端具有12碱基的突出互补的粘性末端 cohensiveend cos 该末端称为cos位点 3 当 侵入宿主细胞后 线状DNA分子借助粘性末端连接成环状分子 DNA基因结构 b2区和重组基因区是 噬菌体进入裂解周期的非必需区 15kb 约占 噬菌体DNA的1 3 可将该区缺失或用外源DNA片段取代 对噬菌体的感染和生长都不会造成影响 4 DNA载体的构建 噬菌体的缺陷 基因组太大 49kb 只能接纳一定长度的DNA 酶切点太多 5个EcoRI位点和7个HindIII位点 噬菌体的改造 切去非必须区段 在切去的同时 加载目的基因 2 5kb或更大 去掉太多的酶位点 每种酶只留1 2个切口 野生型的 DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点 不利于重组操作 必须删除至1 2个 同时 为了便于各种来源的DNA片段的克隆 还需要增加些单一的酶切位点 采用定点突变技术去除或增添酶位点 增加标记基因 4 引入无义突变 体外包装 插入位点 体外包装 插入片段 插入型载体 通过特定的酶切位点允许外源DNA片断插入的载体 0 11kb 体外包装 体外包装 插入片段 插入片段 置换型载体 允许外源DNA片断替换非必需DNA片断的载体 9 23kb 加装选择标记 与质粒不同 野生型 DNA上缺少合适的选择标记 因此加装选择标记是 DNA克隆载体构建的重要内容 DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类 免疫功能类标记imm434颜色反应类标记lacZ 加装选择标记imm434 imm434基因 编码一种阻止 噬菌体进入溶菌循环的阻遏物 含有完整标记基因的 载体进入受体细胞后 建立溶原状态 细菌生长缓慢 形成浑浊斑 当外源DNA插入到标记基因中 基因灭活 重组分子便进入溶菌循环 形成透明斑 加装选择标记lacZ lacZ基因编码 半乳糖苷酶 能催化无色的X gal生成蓝色化合物 当外源基因插入到lacZ基因中 基因灭活 不能合成蓝色化合物 而空载体 DNA则产生蓝色透明斑 构建琥珀密码子的突变体 将野生型 DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG 当这种 DNA进入一般的大肠杆菌菌株后 不能合成有活性的头部蛋白 也就不能被包装和裂解细菌 这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散 而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株 在琥珀密码子位点上可掺入酪氨酸 赖氨酸等一些其他氨基酸 编码完整肽链 DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒 方可高效导入受体细胞 5 DNA重组分子的体外包装 6 DNA及其重组分子的分离纯化 1 将大肠杆菌培养至对数生长期2 加入 噬菌体或重组 噬菌体的悬浮液 37 培养1小时3 用新鲜培养基稀释 继续培养4 12小时4 这时噬菌体颗粒密度已达1013 1014 L 大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心 沉淀噬菌体 苯酚抽提 释放 DNA 乙醇或异丙醇沉淀 DNA 能高效转染大肠杆菌装载能力为25kb 远远大于质粒的装载量重组 DNA分子的提取较为简便适合克隆和扩增外源DNA片段 但不适合表达外源基因 7 DNA作为载体的优点 2700个外壳蛋白分子 M13噬菌体的外型呈丝状M13噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成M13噬菌体不裂解宿主细胞 但抑制其生长M13DNA全长6407个核苷酸M13DNA上至少有10个基因 四 大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA 1 M13噬菌体的生物结构 M13 M13的复制起点 可以插入外源DNA而不影响M13噬菌体的活力 发展出M13mp系列克隆载体 M13ReplicationFormDNA RFDNA 2 M13的生活周期 不导致溶菌 但可使细菌生长变慢 约为正常的1 2 3 4 M13通过雄性细菌的F性菌毛注入其 DNA DNA合成 DNA 形成dsDNA RFDNA DNA转录mRNA 翻译形成噬菌体蛋白 组装成新的噬菌体M13 挤出寄主细胞 3 M13DNA载体的构建 M13mp系列载体 Messingetal 构建 都是从同一个重组M13噬菌体M13mp1改造而来 M13mp1在其主要基因的间隔区插入了一段带有 半乳糖苷酶基因的调控序列及其N端头146个氨基酸的编码信息 lacZ M13噬菌体之寄主菌株可与载体之间产生 互补 4 M13DNA载体的特点 M13重组分子筛选简便 被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢 形成混浊斑 易于辨认挑选 而且重组分子越大 混浊斑的混浊度亦越大使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外 这在DNA定向突变中非常有用可以构建噬菌体文库用来展示抗体 多肽片段最大缺陷是装载量小 只有1 5kb 且不稳定 外源基因容易丢失 M13噬菌体载体遗传稳定性下降原因 带有大片段外源DNA的重组噬菌体 其生长速度总是要比具小片段插入的缓慢得多 因此当外源DNA插入片段发生部分缺失之后 在强大的选择压力作用下 结果经过连续传代之后 在细菌群体中 含有大片段重组噬菌体的细胞比例便被相对地稀释掉了 迈克尔 史密斯 加拿大化学家 利用M13噬菌体进行定点突变 1993年因定点诱变法而获诺贝尔化学奖 利用M13噬菌体进行定点突变原理 噬菌体展示技术 在丝状噬菌体表面 存在3 5个拷贝的基因III编码的蛋白质 其对大肠杆菌雄性菌毛的吸附过程有重要作用 据此 Smith在1985年建立了在丝状噬菌体表面表达蛋白质或多肽的表面展示技术 phagedisplay 五 噬菌粒 phagemid 噬菌粒 这是一类由部分质粒载体和部分单链噬菌体载体结合而成具有双功能的新型载体系列 它们都具有两个复制起点 其一来自ColE1 其二来自单链DNA噬菌体f1 在最简单的情况下 噬菌粒由如下部分构成 质粒