谷胱甘肽的简便测定法.doc

精品文档谷胱甘肽的简便测定法药物分析杂志 2000年第1期第20卷 研究简报作者：赵旭东魏东芝万群俞俊棠单位：赵旭东魏东芝万群俞俊棠（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237）关键词：谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB摘要：目的：建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。方法：样品1式2份，pH 8.0条件下分别和甲醛反应2 min和60 min，各取1 mL加入5 mL DTNB溶液，25 反应5 min后分别测定在波长412 nm的吸光度，算出2者的差值A，代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。结果：谷胱甘肽浓度在0.190.95 gL-1之间线性关系良好，回归方程为：Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，最大误差不超过6%。结论：方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。A Simple Method for Rapid Determination of Reduced GlutathioneZhao XudongWei DongzhiWan QunYu Juntang（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, Institute of Biochemistry,East China University of Science and Technology, Shanghai200237）Abstract：Objective：A new simple method for rapid determination of reduced glutathione in the presence of other thiols is developed based on the reactions of formaldehyde with glutathione and interefering substances.Method:After each aliquot of two same samples reacts with formaldehyde for 2 and 60 min respectively, 1 mL of each solution is added to 5 mL DTNB and reacts for 5 min at 25 . The absorbance is measured immediately at wavelength 412 nm. The difference between two absorbance(A=A2 min-A60 min)is calculated, concentration of glutathione can be obtained from standard curve.Result:There is a good linearity between 0.19 to 0.95 gL-1 glutathione. Regression equation:Y=0.715 4X-0.000 4，r=0.999 9，maximum deviation is less than 6%.Conclusion:The method is cheap, simple, practicable and is applicable to assay of reduced glutathione in the presence of other interefering substances.Key words：glutathione, formaldehyde, cysteine, DTNB谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸组成的天然三肽，用途广泛。利用基因工程微生物生物合成方法是生产谷胱甘肽的主要方式。作为前体之一，半胱氨酸的浓度较高，对谷胱甘肽的测定有干扰。已有几种方法用于半胱氨酸存在时谷胱甘肽的测定：酶分析方法1，2可测高达1 000倍半胱氨酸存在时谷胱甘肽的含量，结果较准确，但需价格昂贵的辅酶和谷胱甘肽还原酶，并且后者活力变化严重影响测量结果；色谱法3，4冗长费时；Jocelyn5采用将样品在硫酸中煮沸1 h的方法，不太安全；Wronski6，7方法效果较好，但需用对羟基汞苯甲酸和萤光黄；荧光法8容易受干扰，误差较大；乙二醛酶法9需要复杂的技术和设备。针对上述方法的不足，本文在研究甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应特点的基础上结合巯基的测定方法10，11提出一种简单，快速的新方法，应用于生物合成反应溶液中谷胱甘肽含量的分析取得满意结果。1仪器和试剂752紫外光栅分光光度计(上海第三分析仪器厂)，恒温水浴槽(上海医疗器械五厂)。GSH，Gys，为生化试剂；3%甲醛溶液由分析纯试剂加水配制，用NaOH调节pH为8.0；0.25 molL-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液由生化试剂配制；0.01 molL-1 DTNB5，5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液由生化试剂加0.05 molL-1 pH 7.0的磷酸缓冲液配制，存于棕色瓶中，放于低温暗处备用；DTNB分析溶液由1体积0.01 molL-1DTNB溶液加100体积0.25 molL-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成，现用现配；其它试剂为分析纯；所用水为去离子水。2分析方法待分析样品(Cys含量不大于20 mmolL-1，GSH浓度小于0.9 gL-1)1 mL 2份，每份加入0.25 molL-1 pH 8.0的Tris-HCl缓冲液3 mL，摇匀，再加入3%甲醛1 mL，摇匀，室温下分别准确静置2 min和60 min后，立刻取1 mL加入预先恒温于25 水浴中的DTNB分析溶液5 mL，摇匀，准确静置5 min后，立刻在波长412 nm处测定吸光度A，算出2者的A值之差A，代入回归方程计算相应谷胱甘肽浓度，最大误差不超过6%。3结果3.1显色溶液的稳定性准确称取GSH溶于pH 6.5去离子水配成0.48 gL-1的标准溶液，取1 mL按上述方法分析，已知室温为26 ，5 mL DTNB溶液预先恒温于25 水浴中，分别加入已与甲醛反应2 min和60 min的样品溶液1 mL后迅速摇匀，以此刻作为反应开始，于不同时间测定吸光度，见表1。可知反应开始1.5 min到10 min之间显色溶液保持稳定，考虑到因季节不同，与甲醛反应后的样品溶液温度变化，1 mL该溶液加入5 mL预先恒温于25 水浴中的DTNB溶液后需13 min才能恢复到25 ，选择5 min为反应时间。表1显色溶液在不同反应时间的吸光度反应时间/min反应2 min的样品反应60 min的样品0.50.6720.0111.50.6800.0132.50.6800.0135.00.6800.013100.6800.013150.6780.012200.6780.012300.6700.011600.6490.006 3.2标准曲线的制作谷胱甘肽含有疏基，按照疏基的测定方法11，12可求出GSH的含量。准确称取GSH溶于pH 6.5去离子水配成0.95 gL-1的标准溶液，分别取该溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，相应加入0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL pH 6.5的去离子水，用水代替甲醛作为对照。按分析方法与甲醛反应2 min和60 min后测定结果见表2。以Y为纵坐标，表示GSH(gL-1)浓度，以X为横坐标，表示A，用最小二乘法计算得回归方程和相关系数为：Y=0.715 4X-0.000 4r=0.999 9说明线性关系良好。 表2GSH浓度(gL-1)与A之间的关系GSH加入量/A2 minA60 minAgL-1A2 min-A60 min0.000.0000.0000.0000.190.2720.0130.2590.380.5530.0170.5360.570.8300.0270.8030.761.1010.0301.0710.951.3520.0341.318 3.3甲醛同Cys和GSH的反应速度配制浓度为0.95 gL-1的GSH标准溶液和2.6 gL-1的Cys标准溶液，按分析方法分别与甲醛反应不同时间后测量A值，用水代替甲醛作为对照。结果表明(表3)：室温下pH 8.0时，和甲醛反应2 min后，98.94%的Cys被掩蔽，而GSH只有3.08%；反应1 h后，97.56%的GSH也被掩蔽，由此可知，甲醛同半胱氨酸的反应更快。利用这种反应速度的差异，可以分别测定Cys和GSH的浓度；由此启发研究其他含疏基物质与甲醛的反应特性。 表3甲醛同Cys和GSH的反应速度与甲醛反应 时间/minGysGSHAA02.159(对照)1.395(对照)10.24011.221.38499.2120.0231.061.35296.9230.0190.881.32995.27300.0190.880.33524.01600.0180.880.0342.44 3.4多种含疏基物质共存时GSH含量分析生物合成GSH溶液中含有细胞泄漏物如辅酶A、蛋白质等含疏基物质，提取时还用到疏基乙醇和NaHSO3还原氧化型GSH这些物质干扰GSH的分析。进一步研究甲醛同这些物质的反应性质如表4所示。 表4各种含疏基物质同甲醛的反应性质及对GSH测定的影响编号样品A2 minA60 minA2 min-A60 min对GSH测定的影响10.2 mL GSH(0.95 gL-1)0.2720.0130.25920.2 mL Cys(2.6 gL-1)0.0050.0020.003小30.2 mL巯基乙醇(31.67%)0.4990.4940.005小41 mL二硫苏糖醇(0.21 gL-1)c0.6830.1170.556很大51 mL NaHSO3(1.08 gL-1)0.1190.121-0.002小61 mL木瓜蛋白酶(2.7 gL-1)a0.0720.0710.001小71 mL-半乳糖苷酶(3 gL-1)a0.1870.1870.000没有80.8 mL酵母细胞裂解液0.1700.1150.055大(蛋白质浓度53 mgL-1)b90.5 mL E.coli细胞裂解液0.0450.0320.013大(蛋白质浓度39 mgL-1)ba.这2种酶含有巯基，用来说明甲醛同蛋白质巯基的反应性质b.生物合成GSH的反应系统含有固定化酵母和E.coli细胞，溶液中有这2种细胞的泄漏物如蛋白质、辅酶等含巯基物质，分析这2个样品是为了检验这些含巯基物质对GSH测定的影响c.二硫苏糖醇与巯基乙醇和NaHSO3不同，因为和甲醛反应使它的A值减小许多，给分析带来麻烦；还原反应溶液中的氧化型GSH时只采用巯基乙醇和NaHSO3表4结果表明，除二硫苏糖醇外，与甲醛反应的常见含巯基物质基本上可分为4种，第1种和甲醛反应2 min后，几乎完全被掩蔽，如半胱氨酸；第2种和甲醛反应的时间越长，被掩蔽的越多，以致最后被掩蔽，如谷胱甘肽、酵母和E.coli细胞裂解液中的未知成分；第3种与甲醛的反应在2 min时就已完成，部分被掩蔽，2 min和60 min时的A值几乎一样，如NaHSO3和木瓜蛋白酶；第4种是基本上不与甲醛反应，如巯基乙醇和半乳糖苷酶。通过求取和甲醛反应2 min和60 min时的A值之差，可将第1、第3、第4种物质的干扰消除；第2种含巯基物质共存时，可设立不含GSH的溶液作为对照来消除干扰，如在测量生物合成反应溶液中的GSH浓度时，以不加GSH前体的溶液作为对照。总之，无论哪一种干扰物质和GSH共存，采用本文的分析方法都可以测定GSH含量。各种样品按照分析方法测定的GSH含量如表5所示，每种样品测定之前用水补加至体积为1 mL，表中数据为2次分析的平均值。表5各种样品的GSH含量分析结果样品GSH加入量/ gL-1A2 minA60 minA2 min-A60 min测量值/ gL-1测量值与 加入量之比/%1样品1+样品20.1900.2800.0040.0160.0040.2640.18898.952样品1+样品3+0.2 mL样品50.1900.7950.0120.5330.0170.2620.18798.423样品1+0.2 mL样品5+0.2 mL样品60.1900.3080.0080.0560.0140.2520.18094.744样品1+样品8a0.1900.4400.0290.1300.0110.254a0.18195.265样品2+0.3 mL样品8+0.3 mL样品9a0.0000.0990.0100.0710.0090.0286样品1+样品2+0.3 mL样品8+0.3 mL样品90.1900.3820.0350.0950.0130.259a0.18597.37注：样品编号见表4a.分析样品6必须设立对照，即样品5，原因见文中解释；计算样品6的GSH含量时，应采用样品6的A与样品5的A之差0.