VEGF的生物学基础与朗沐药学

VEGF生物学基础与朗沐药学基础知识,陶杉,目录,VEGF的定义,VEGF：Vascular Endothelial Growth Factor，血管内皮生长因子，是一类多功能的细胞因子，在血管生成和淋巴管生成中具有直接和间接的调控作用。VEGF主要有7种亚型：VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，VEGF-E，VEGF-F和PlGF（Placenta Growth Factor）。其中只有VEGF-A，VEGF-B和PlGF与血管新生相关。,VEGF的分子结构,VEGF-A的基因经过剪切拼接后可形成不同单体，如121, 165,183等。数字代表相应的氨基酸残基数量。其中VEGF165是眼部新生血管的主要诱因。VEGF通常以同源二聚体的形式存在，2个亚基的分子质量（MW）为1723 kDa，通过两对二硫键共价连接。kDa: kiloDalton，千道尔顿，也写作kD。,VEGF的合成和靶细胞,所有眼部分布血管的组织都可合成表达VEGF，相关细胞包括：视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE），周皮细胞（也称周细胞），内皮细胞，穆勒细胞和基质细胞等。VEGF的主要靶向细胞为血管内皮细胞,RPE,视网膜外层,穆勒细胞,视网膜中层,视网膜内层,视网膜感觉神经细胞,VEGF的作用,1. VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活；2. VEGF可以增加血管通透性，扩张血管；3. VEGF可以聚集血管前体细胞和单核细胞。,VEGFR的定义,VEGFR：Vascular Endothelial Growth Factor Rceptor，血管内皮生长因子受体，是一类受体酪氨酸激酶跨膜糖蛋白，与VEGF结合后通过构象变化和磷酸化传递相应信号。VEGFR主要有3种亚型：VEGFR-1，VEGFR-2和VEGFR-3。VEGF刺激内皮细胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通过结合和激活VEGFR-2来实现的。VEGFR-3不参与血管新生信号通路中。,VEGF受体的分子结构,VEGFR平时以单体形式存在。分为胞外区、跨膜区和胞内区三大部分。胞外区部分由7个与免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)结构相似的结构域组成。胞内区部分属于酪氨酸激酶区，可以发生自磷酸化来向下游传递信号。,VEGF受体的分子结构,VEGFR的胞外区的7个免疫球蛋白样结构从N端开始依次命名为D1-D7。VEGFR-1（Flt-1）可以结合VEGF-A、VEGF-B和PlGF，其D2区就是与配体结合的位点。VEGFR-2（KDR，Flk-1）只能结合VEGF-A，其D2和D3区是配体结合位点，D3区对于配体结合的专一性起作用。D4区对受体的二聚体化很关键，并可增强VEGF与VEGFR的结合速率。,D1,D7,VEGF与眼部新生血管疾病有关,证据：脉络膜新生血管膜中检测到VEGF165 ，VEGF-B和PlGF；PDR（增殖性糖尿病视网膜病变）患者的玻璃体腔中PlGF的浓度明显升高；眼内注射VEGF会引起和DR相同的表现，如微动脉瘤、出血、视网膜和虹膜新生血管。以上说明，VEGF与眼部新生血管疾病有关：1. 从通透性到新生血管构建，视网膜脉管系统的病态改变都与VEGF表达量增加有关。2. 仅需VEGF就可触发眼内新生血管形成。3. 抑制VEGF可改善眼部功能和结构。,VEGF表达增加的诱因,缺氧、炎症和机械力会上调细胞合成VEGF。,VEGF的作用机制,VEGF结合到VEGFR，通过D4区使其发生二聚体化现象，VEGF则桥接在受体的D2区或者D2和D3区之间。,VEGF的作用机制,VEGF与VEGFR的结合会引发受体构象变化和自磷酸化，并使下游蛋白发生磷酸化，传递血管新生和血管渗漏的信号。,P,P,眼部新生血管类疾病种类,VEGF诱发的病态性血管新生疾病主要分为两种：肿瘤和眼部新生血管失调。眼部新生血管疾病根据临床表现又可分为三种：增殖型（Proliferation），渗漏型（leakage）和增殖渗漏型（Proliferation and leakage）。增殖型眼病：增殖型糖尿病视网膜病变（PDR），早产儿视网膜病变（ROP），新生血管性青光眼（NVG）渗漏型眼病：视网膜静脉阻塞（RVO），糖尿病黄斑水肿（DME），中心性浆液性脉络膜视网膜病变（CSC）增殖渗漏型眼病：湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD），视网膜血管瘤增殖（RAP），病理性近视CNV（pmCNV）,眼部新生血管类疾病的拮抗途径,1.移除诱导VEGF表达量增加的条件：全视网膜激光光凝术，玻璃体切割术改善视网膜内氧环境，降低低氧诱导的VEGF表达；2.下调VEGF和VEGFR的表达：眼内注射曲安奈德，地塞米松3.阻断VEGF与VEGFR的结合：哌加他尼钠特异性结合VEGF-A165；贝伐单抗，雷尼单抗结合所有VEGF-A；阿柏西普，康柏西普结合所有VEGF-A、VEGF-B和PlGF。,康柏西普的生物学与药学基础,康柏西普的来历,抗VEGF药物的阻断途径：1. 通过结合VEGF使之不能再与VEGFR结合2. 通过结合VEGFR使VEGF不能再与受体结合单抗类药物均采用了阻断途径1通过杂交瘤细胞技术获得。,VEGF-A,贝伐单抗，Avastin,雷珠单抗，Ranibizumab,雷珠单抗生产工艺,雷珠单抗和贝伐单抗最开始是以单克隆抗体技术制备筛选的。单克隆抗体技术又叫杂交瘤细胞技术，是融合了小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞来生产抗体的技术。因为小鼠脾细胞经过特定抗原（VEGF）刺激后会产生分泌相应抗体（抗VEGF抗体，如贝伐单抗），但是小鼠脾细胞不能繁殖，如果需要较多量的稳定单抗，就要把脾细胞与可以无限繁殖的肿瘤细胞进行融合，这样既可以分泌抗体又能保持细胞永生。由于VEGF刺激的是小鼠脾细胞，因此产生的抗体无可避免都会有鼠源性的氨基酸序列。而且由于抗体的可变性，不同次的刺激可能产生不同的抗体，因此最后是在多种抗体中筛选出贝伐单抗和雷珠单抗的全体。然后对这两个单抗的氨基酸序列（雷珠是Fab片段的序列）进行鉴定后即可根据基因密码子表获得相应的DNA，然后将DNA序列转入大肠杆菌中进行诱导表达，就能大批量培养获得稳定的雷珠单抗了。因为用大肠杆菌表达蛋白一般来说快速方便稳定又便宜。,康柏西普的来历,抗体存在两个问题：1. 抗体的高度特异性使其只能与VEGF的一个亚型VEGF-A结合，而不表现出对VEGF-B和胎盘生长因子（PlGF）的亲和力；2. 杂交瘤细胞技术生产的抗体部分氨基酸组成和序列是鼠源性的，而非全人源化蛋白。,康柏西普的来历,VEGF的各亚型都通过结合VEGFR-1和2来发挥作用。模拟受体与VEGF结合位点的结构，可降低免疫原性，并能与所有VEGF亚型结合。VEGFR-1和2的胞外域是与VEGF上的不同位点结合，因此这种模拟受体需要融合VEGFR-1和2两种蛋白的配体结合位点才能完全抑制VEGF与受体的结合。,康柏西普的来历,FP3表现出最高的VEGF的亲和力，最强的抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖的能力。,VEGFR-1 VEGFR-2,康柏西普的分子量约为143kD,其受体样区域是同源二聚体样结构，很好地模拟了VEGFR与VEGF结合的活性形态康柏西普的7个糖基化位点均发生糖基化，使得康柏西普的pI值在5.68-7.47之间，对眼部刺激性小D4区使得二聚体样结构更稳定更方便VEGF的桥接，也具有更快的VEGF结合速度。,康柏西普的结构,康柏西普生产工艺,康柏西普最开始是从人VEGF受体1和受体2的胞外免疫球蛋白样区域分别随机融合并连上人IgG的Fc片段形成的融合蛋白中筛选出来的，这种融合就是将表达这些蛋白区域的DNA序列通过连接酶有序地连接在一起，再转入CHO细胞中进行诱导表达即可获得。由于DNA对应的蛋白均为人源化蛋白，因此康柏西普是100%全人源化的蛋白。之所以选用CHO细胞，一是因为大肠杆菌中没有辅助真核蛋白正确折叠形成活性状态的酶，因此表达出的分子不可溶、无活性，而CHO作为真核细胞，这些酶是有的；二是因为康柏西普蛋白上有多个糖基化位点，而大肠杆菌不能对人源化的糖基化位点进行糖基化，也会影响蛋白的状态和活性；第三是因为CHO细胞表达技术是现在真核表达细胞中相对成熟稳定的技术，已经用于工业生产。,康柏西普的活性研究,康柏西普的体外活性研究康柏西普的体内活性研究,康柏西普的体外活性研究,ELISA检测FP1、FP3和贝伐单抗对VEGF的亲和力,FP1：阿柏西普；FP3：康柏西普,康柏西普显示出更高的VEGF亲和力。贝伐单抗的特异性使其不能与VEGF-B和VEGF-C以及PlGF结合。,康柏西普：EC50=28 pM 雷珠单抗：EC50=50 pMEC50：半数有效浓度，即能引起50%最大效应的药物浓度。EC50值越大，说明药物的作用越低。,康柏西普和雷珠单抗对VEGF诱导的HUVEC增殖活性的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普对HUVEC迁移的抑制作用呈现剂量依赖性，其IC50为7nM。IC50：半数抑制浓度， 即能引起50%抑制效应的药物浓度。IC50值越大，说明药物的作用越低。,康柏西普对VEGF诱导的HUVEC细胞迁移过程的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普可显著抑制VEGF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成。,康柏西普对VEGF诱导的微血管萌芽和毛细血管样网络形成的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普即可达到最大结合人视网膜内皮细胞（HREC）分泌的VEGF165的作用，也可显著降低游离的PlGF浓度。,康柏西普对高糖诱导的HREC分泌VEGF-165和PlGF的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖诱导的HREC的迁移。,康柏西普对高糖诱导的HREC迁移的影响,康柏西普的体外活性研究,500 ng/mL的康柏西普可有效抑制高糖诱导HREC形成毛细血管样网络。,康柏西普对高糖诱导的HREC成网过程的影响,康柏西普的体外活性研究,康柏西普治疗组的渗漏明显比未治疗组少，说明康柏西普可抑制新生血管生成。,低氧诱导小鼠缺血性视网膜病变抑制实验的眼底造影,康柏西普的体内活性研究,激光后立刻注射康柏西普，之后B组每周注射一次，C组两周注射一次。B组和C组的渗漏明显比未治疗组少，说明康柏西普可预防新生血管生成。,康柏西普预防恒河猴激光灼伤CNV实验的眼底造影,康柏西普的体内活性研究,康柏西普抑制恒河猴激光灼伤CNV实验的OCT结果,激光灼伤恒河猴后20天，治疗组分别注射康柏西普500、300和100 g，并在注射8天后观察。相比对照组，8天后治疗组均未观察到高反射回声区，RPE恢复连续性，黄斑水肿消除，说明康柏西普可有效抑制CNV。,康柏西普的体内活性研究,康柏西普抑制恒河猴激光灼伤CNV实验的FFA结果-500 g组,激光灼伤20天后，注射0天,注射14天后,注射28天后,康柏西普的体内活性研究,Zhang Ming,et al. Ophthalmology. 2011 Apr;118(4):672-8.,康柏西普治疗后42天，患者BCVA平均提高了19.61个字母。中央视网膜厚度平均降低了77.19 m。,康柏西普的体内活性研究,康柏西普3.0mg组的患者基线和治疗42天后OCT与FFA结果,Zhang Ming,et al. Ophthalmology. 2011 Apr;118(4):672-8.,康柏西普的体内活性研究,康柏西普的药物代谢动力学研究,康柏西普的兔眼药代动力学研究康柏西普的恒河猴药代动力学研究,重要药代指标：Cmax：最大药物浓度，给药后体内检测到的最大药物浓度。Tmax：达峰时间，到达Cmax的时间，所需时间越短，说明药物分散越快。t1/2：药物清除半衰期，药物浓度下降一半所需要的时间，值越大说明药物在体内存留时间越长。,药物代谢动力学的指标,康柏西普的兔眼药代动力学研究,玻璃体腔注射0.5mg(A,Group 1)和1.5mg(B,Group 2)康柏西普在玻璃体、房水、脉络膜-PRE、视网膜中的药代参数,康柏西普注射玻璃体腔后6-12h内在各组织中达到最高药浓度，之后以单指数模式下降，说明在浓度梯度推动下会快速分散到玻璃体腔及周围组织。雷珠单抗在玻璃体腔中的Tmax为24h，但Cmax只有162g/mL，t1/2为2.88天。,康柏西普的兔药代动力学研究,康柏西普在血清中的时药浓度,Group 1: 玻璃体腔注射0.5mg; Group 2: 玻璃体腔注射1.5mg; Group 3: 静脉注射3mg玻璃体腔注射后血清中康柏西普的浓度较低，在6-12天后检测不到。静脉注射后康柏西普以双指数模式消除，半衰期短于玻璃体腔注射。,给予健康猴子单次注射康柏西普，并分别在2、7、15天检测眼部组织中的康柏西普浓度。结果发现，在注射后15天依然可以在眼部组织中检测到康柏西普，且玻璃体腔中浓度最高，说明玻璃体腔中的康柏西普可以长期良好地分布到周围组织中，具有较长的眼内停留时间。,康柏西普的恒河猴药代动力学研究,康柏西普玻璃体腔注射后眼部分布,康柏西普的血清药代动力学指数,康柏西普注射后在设置的时间点取血，检测血清中的康柏西普浓度。结果发现大约4小时后能在血清中检测到，平均34小时后达到峰浓度5ng/ml，这比玻璃体内浓度低1000倍；而0.5mg雷珠单抗在血清中6小时达峰浓度1