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精品 动物寄生虫病PCR诊断技术 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）技术是一种既敏感又特异的DNA体外扩增方法，它可将一小段目的DNA扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅部分虫体的微量DNA。通过设计种、株特异的引物，此法只扩增出种、株特异的PCR产物，具有很高的特异性。而且PCR技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行分离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰，直接检测到病原体的DNA，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫病的分子流行病学调查。随着PCR技术的不断完善与发展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床医学等各个领域，具有广泛的应用前景。一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的基本原理，全面熟悉PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.虫体材料。 单个虫体。2.器具。 超净工作台、恒温培养箱、TGL-16G高速台式离心机、旋涡振荡器、微量取液器及配套吸头、微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。3.试剂。(1) 乙二胺四乙酸（ Ethylene diaminetetra acetic acid，EDTA）、十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸（Tri (Hydroxymethyl) Aminomethane-HCl，Tris-HCl）、氯化钠、蛋白酶K（25g/l）、异丙醇（80%）、双蒸水、灭菌超纯水等。(2) DNA裂解液：500 mM NaCl 70 l 、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）30 l、50 mM EDTA（pH 8.0）150 l、10%SDS 30 l。(3) WizardTM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的DNA提取试剂盒。（二）PCR扩增及琼脂糖电泳1材料。 提纯的虫体DNA。2器具。 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器（2/20/200/1000 l）、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管（200/500/1500 l）、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒（100 ml）、三角瓶（500 ml）等。3试剂。(1) 10PCR Buffer（无Mg2+）、dNTP（2.5 mM each）、ddH2O 、MgCl2（25 mM）、Primers、Ex Taq酶（5 U/ml）、琼脂糖、EB（10mg/ml）、Tris碱、硼酸（Boric acid）、去离子水、EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）、10载样缓冲液。(2) 0.5TBE缓冲液：准确秤取Tris碱5.4g，硼酸2.75g，充分溶解于800 ml去离子水中，加10ml 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），用去离子水定容至1000ml。（三）PCR扩增产物的纯化1材料。 PCR扩增产物。2器具。 TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器（2/20/200/1000 l）、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4/-20冰箱、紫外透射仪、微型离心管（500/1500 l）、有机架、透明胶带、一次性注射器、量筒（100ml）、三角瓶（500ml）、手术刀、保鲜纸等。3试剂。 琼脂糖；0.5TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇（80%）等。三、实验方法、步骤和操作要领(一) 寄生虫基因组DNA的提取及纯化1.实验原理。 应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA。寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学鉴定以验证其种类。如果虫体较小（小于1 cm），则应使用整条虫体抽取DNA。若虫体特别细小（例如幼虫），可用多条虫体来提取DNA。为了获得高含量、高纯度的DNA，最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70%乙醇保存的寄生虫材料中也可较容易地提取DNA。寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的基本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后加入DNA裂解液和蛋白酶K，充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用WizardTM DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其混合液在通过微型柱时DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除残余杂质。最后，在微型柱中加入预热的TE缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。2实验方法、步骤和操作要领。(1) 虫体材料的处理(若为新鲜或冻干保存的虫体，则不需要此步骤)。若虫体较大，用镊子将保存在70%的酒精溶液中的虫体材料取出，剪取其中部，保存其头端或尾端部分。用双蒸水反复吹打冲洗2次后，再用超纯水反复冲洗23次，置于一新的1.5ml的离心管中。若虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。对于鸡球虫，将保存在2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000g离心10min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊20min，2000g离心沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500g离心10min，上清液加入4倍体积的灭菌双蒸水，3000g离心10min。卵囊沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M无菌蔗糖溶液之上，2000g离心5min，取上层卵囊加5倍体积的水，3000g离心10min，沉淀再用无菌蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯净的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2) 虫体材料的裂解。用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎，加入280l的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再加入20l（25g/l）的蛋白酶K溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫，将纯化好的卵囊3000rpm/min 离心10min，去掉大部分上清后加入与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95卵囊破壁后，即可加入SDS裂解缓冲液及蛋白酶K溶液。混匀后，放于恒温培养箱中，37作用1248 h，其间不时摇动离心管，使虫体组织裂解充分。(3) 虫体DNA的抽提和纯化。首先进行虫体DNA提取，然后按Promega公司试剂盒WizardTM DNA Clean-Up System使用说明对DNA进行纯化。方法如下： 取出于恒温培养箱中作用了约20小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀，10000rpm离心2min，上清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管中，加入1ml清洗树脂（按50500l悬液/1 ml清洗树脂的比例），旋涡震荡混匀。 取一支5ml的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上WizardTM微型柱。 将DNA-树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将DNA-树脂混合液推过微型柱，排出废液。 将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2 ml 柱洗溶液（80%的异丙醇），用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。 拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec，以除去残留的异丙醇。 将微型柱从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央加入3050l预热（6070）的超纯水或1TE缓冲液，静置1 min，10000rpm离心20sec。离心管内的液体即为DNA溶液。可将DNA溶液转移至0.5 ml离心管中于-20冰箱保存备用。（二）寄生虫DNA的PCR扩增及琼脂糖电泳1.实验原理。(1) PCR引物设计。 PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。PCR引物设计的目的是找到一对合适的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以下原则： 长度不能太长，也不能太短，一般在1825个碱基左右； G+C含量及Tm值：引物的G+C含量以40%60%为宜。引物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR引物应保持合理的G+C含量。含有50%G+C的20个碱基的引物其Tm值约界于5662，这可为有效退火提供足够的温度。由于G+C间的氢键数较A+T间多，因此，G+C含量高的DNA片段其Tm值也高。对于短于20个碱基的引物，Tm值可按Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算。而对于较长的引物，Tm值的计算较为复杂。由于PCR扩增的特异性取决于两条引物与相应模板的结合，因此，反应中退火温度应根据两个Tm值折衷选择。 碱基的组成尽量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3 末端不应超过3个连续的G或C； 引物内部不应有互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。这样二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若引物自身连续互补碱基达3个以上，就容易形成发夹结构。 两个引物之间不能互补，尤其应避免3 末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4个以上的碱基连续相同或互补； 引物的3 末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。如果能确定一个保守氨基酸，可将其密码子的前2个碱基作为3 末端。 引物的5末端可不与目的片段互补，可被修饰而不影响扩增的特异性。引物的5末端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点，在限制性酶识别序列的5端常需添加2-3个非特异的额外碱基。 若是设计种或株特异性引物，引物与非特异序列的相似性不能超过70%或有连续8个以上的互补碱基相同。可用DNAstar、MegAlign软件比较相似性，用Oligo50来设计引物。(2) PCR的基本原理。 在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液（Mg2+）的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性，退火（复性），延伸三步反应为一周期（cycle），循环进行，使目的DNA片段得以扩增。由于每一周期所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍。在实际应用中，一般多用3035个循环。(3)琼脂糖电泳的基本原理。 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，于沸水中溶解，45开始形成多孔性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场的作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。2.实验方法、步骤和操作要领。(1) PCR扩增。 先按单倍扩增体系中各试剂的量计算好n倍（除去模板DNA量）扩增体系中各试剂相对应的量，然后在适合体积的离心管中依次加入试剂（如n2.5 l 10PCR Buffer、n2 l dNTP，n4 l MgCl2、n0.5 l Forward primer、n0.5 l Reverse primer、n14.4 l ddH2O、n0.125 l Ex Taq酶，最后总体积为n24 l），经离心混匀后，分装至n个200l的离心管中（包括阴阳性对照），在各管中加入模板DNA（如扩增体系为25 l，则加入1 l模板DNA），混匀后于PCR扩增仪中按已设好的PCR扩增条件进行扩增。如细胞色素c氧化酶第一亚基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1）基因的扩增体系为：试剂 体积（l） ddH2O 14.37510x PCR Buffer 2.5MgCl2 (25 mM)4.0dNTPs (2.5 mM each)2Forward primer (100 pmol/ml, JB3)0.5Reverse primer (100 pmol/ml, JB4.5)0.5Ex Taq (5 U/ml)0.125模板 (gDNA)1_ 总量25coxI基因的PCR扩增条件：94变性 5 min94变性30 s 55复性30 s 30个循环72延伸30 s72延伸5 min 扩增完毕后，取出PCR扩增产物于4/-20冰箱保存备用。(2) 琼脂糖凝胶电泳。 制备凝胶：胶浓度视具体情况而定。以配制0.8%琼脂糖凝胶为例，准确称取0.8 g琼脂糖加入至100 ml 0.5TBE电泳缓冲液，于微波炉中或经高压熔化均匀，冷却至50左右，加入溴化乙锭（EB）（10 mg/ml, 加入量为8.3 l EB/100 ml琼脂糖凝胶液），混匀后倒入已封好的凝胶灌制胶模中，插上样品梳。待胶凝固后，从胶模上除去封带，拔出梳子放入电泳槽中，加入足够量的电泳缓冲液（要求缓冲液液面高出凝胶表面约1 mm）。 点样：取PCR扩增产物35 l，与适量的加样缓冲液（Loading buffer, LB）混匀(若为6XLB，3-5 l扩增产物加1 l 6X LB)，然后用取液器将样品加入点样孔中，同时设以适宜的DNA分子量标准物（marker）作为参照。 电泳：接通电极，使DNA向阳极移动，在110 V/cm凝胶的电压下（常用100 V）进行电泳。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段的距离时，关闭电源。 结果观察：将电泳好的琼脂糖胶置于紫外透射仪中，打开紫外灯，若看到橙红色的核酸条带，则说明有扩增的PCR产物；根据条带粗细，可粗略估计该条带的DNA量；根据已知分子量的标准DNA对照，通过线性DNA条带的相对位置可初步估计扩增产物的分子量。如果仅出现预期分子量大小的条带而无非特异性条带，则说明扩增的特异性较好。如果扩增结果比较满意，则用凝胶成像系统进行摄影，保存图像。（三）PCR扩增产物的纯化1.实验原理。 为验证PCR扩增产物的种或株特异性，往往需对PCR扩增产物进行测序验证。为了建立种、株特异的PCR诊断技术，需要确定种、株特异的遗传标记。在这样的情况下，往往需要将PCR产物进行纯化，连接到克隆载体，转化宿主菌，然后经菌落PCR及限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性菌落进行测序。获得纯度高的PCR产物是进行连接、转化、测序的前提条件。PCR产物的纯化方法一般有两种：一种是切胶回收，另一种是PCR产物直接回收。切胶回收的原理就是通过琼脂糖凝胶电泳，将要回收的目的片段从凝胶上切下来，然后再通过DNA胶回收试剂盒进行纯化，以去除DNA样品中除了目的基因片段外的所有杂质。而PCR产物直接回收法则是将扩增的PCR产物直接用PCR 产物纯化试剂盒进行纯化。两种方法各有利弊，切胶纯化的纯度较高，但回收率低；PCR产物直接纯化，回收率高，但纯度较低。如果PCR扩增产物很特异，且引物长度小于60 bp，则两种方法都可选用，但如果有非特异性条带或引物长度大于60 bp时，就必须用切胶纯化的方法。2.实验方法、步骤和操作要领。(1) 切胶纯化法(按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式DNA胶回收试剂盒说明进行)： 取4050 1 PCR产物于0.8的琼脂糖凝胶中电泳约4050 min（可适当缩短电泳时间以提高回收效率）。注意：必须将电泳槽用自来水充分冲洗，电泳缓冲液一定要换新鲜干净的，以保证不会有其它DNA污染。 于紫外透射仪中铺上一块新鲜的保鲜纸，将凝胶放在保鲜纸上（以尽量提高DNA回收的纯度），打开长波紫外灯用干净的手术刀快速将目的片段从琼脂糖凝胶上切下来（尽可能去除多余的琼脂糖胶）。切下来的胶块放入一新鲜、灭菌的1.5 ml的离心管中，用电子天平称重并作好记录。 按每100 mg琼脂糖凝胶或100 l的DNA溶液加入400 l Binding buffer的量来计算，加入相应体积的Binding buffer，混匀后置于5060水浴中10分钟，使胶彻底融化（加热融胶时，每2分钟混匀一次）。 将融化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，用台式离心机高速（8000 rpm）离心1 min。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，加入500 l Wash solution，高速离心（10000 rpm）30 sec。 重复步骤“”一次。 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，高速离心（10000 rpm）1 min。 将UNIQ-10柱放入一新鲜洁净的1.5 ml离心管中，在柱膜中央加30 l Elution Buffer或双蒸水（pH7.0）到UNIQ-10柱中，室温或37放置2 min。（提高洗脱温度至55-80有利于提高DNA的洗脱效率） 10000 rpm高速离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20备用。 取35 l PCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，琼脂糖电泳检查回收率，可根据带的亮度估算DNA回收纯化后的浓度。(2) PCR产物直接纯化法（按生工生物工程(上海)有限公司UNIQ-5柱式PCR产物纯化试剂盒说明进行）： 取PCR产物4050 l，加入3倍体积的Binding buffer，混匀。 把混合液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，用台式离心机高速（8000 rpm）离心1 min。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。 倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500 l Wash solution，高速离心（10000 rpm）30 sec。 重复“”步骤一次。 倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放回收集管中，高速离心（10000 rpm）1 min。 将UNIQ-10柱放入一根新鲜洁净的1.5 ml离心管中，在柱膜中央加入30 l Elution Buffer或双蒸水（pH7.0）到UNIQ-10柱中，室温或37放置2 min（提高洗脱温度至55-80有利于提高DNA的洗脱效率）。 10000 rpm高速离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20备用。 取510 l PCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，电泳检查回收率，可根据带的亮度估算DNA回收纯化后的浓度。（六）动物寄生虫病特异PCR诊断技术实例以检测鸡柔嫩艾美尔球虫感染为例，选用Fernandez等（2003）报道的柔嫩艾美尔球虫种特异的引物(Tn-01-F：5-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3; Tn-01-R：5-CCGCCCAAACATGCAAGATGGC-3)，建立特异、敏感、快速的特异PCR诊断技术，用于鸡柔嫩艾美尔球虫感染的诊断及分子流行病学调查。1PCR反应。 按常规方法进行，在0.2ml PCR管配制反应液，总体积为25L，其中：试剂 体积（l） 10x PCR Buffer 2.5MgCl2（25 mM）2.5dNTPs（2.5 mM each）2Forward primer（Tn-01-F, 50 pmol/l）0.275Reverse primer（Tn-01-R, 50 pmol/l）0.275ddH2O16.2rTaq （5 U/l）0.25_模板（gDNA）1同时设阳性对照和空白对照。2反应在PCR仪上进行。 反应条件为：96预变性5 min，然后94变性1min、65退火2min，共30个循环，最后72后延伸7 min。3. 结果判定。 PCR产物在1.0%TBE琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果。阳性对照可见分子量大小约530bp的条带；临床样品如有同样大小条带判为阳性；阴性对照不见扩增条带。 四、实验注意事项（一）寄生虫基因组DNA的提取及纯化1操作中所使用的镊子和剪刀一定要事先灭菌并于超净工作台中紫外照射11.5 h，以保证没有污染其它DNA。2吸取上清液时，应注意勿将下层沉淀物吸入以免带入杂质，但也不要余下太多上清液，致使DNA损失较多。3整个操作过程