血浆-血清-体液蛋白质组学

血浆、血清、体液蛋白质组学研究及其应用,1,蛋白组学基本知识,2,血浆、血清蛋白组学,唾液蛋白组学,尿液蛋白组学,脑、脊液蛋白组学,一、蛋白组学基本知识,3,4,蛋白质组(proteome = protein + genome):一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质蛋白质组学（proteomics)研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学,5,基本生物学问题Post-translational modificationProtein-protein interactionGenome-Transcriptome-Proteome临床应用问题Disease marker-diagnosisDrug target-therapy,Proteomics,6,蛋白质组研究的基本技术,分离,Gel-based,Liquid-based,HPLC,FFE,SCX, RP, SEC,鉴定,MS,MALDI-TOF-MS,ESI-MS,MS-MS,2D-HPLC,MALDI-TOF-TOF,MALDI-Q-TOF,ESI-MS-MS,LC-ESI-MS-MS,计算机技术,7,IEF: isoelectric focusing (等电聚焦),2-DE：Two-dimensional gel electrophoresis,第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离；第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离， 把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开,HPLC：High-performance liquid chromatography or high-pressure liquid chromatography (高压液相色谱法),DIGE：2-D difference Gel Electrophoresis,基本缩略词,iTRAQ: Isobaric tag for relative and absolute quantitation 同位素标记相对和绝对定量,8,质谱仪分为进样系统、离子源、质量分析器和检测器四部分。离子源又分为：电子轰击源 (Electron Ionization，EI)化学电离源 (Chemical Ionization，CI)场致电离源 (FI)电喷雾电离源 (Electro Spray Ionization，ESI) 等,MS是单级质谱，适用于样品不是特别复杂的样品分析。 对于复杂样品，单级质谱会出现很多干扰峰，影响测定。,MS：Mass Spectroscopy (质谱),MS/MS是串联四级杆质谱，通过两个质量分析器间的碰撞室进行 一定能量的碰撞，选择性的扫描碰撞后得到的子离子碎片，不符合 一定质量数的离子被抛弃，这就降低了背景噪音、大大提高了检测的 灵敏度和准确度。,基本缩略词,9,ESI-MS：Electro Spray Ionization-Mass Spectroscopy， 电喷雾质谱,MALDI-TOF-MS：Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/ Time of Flight Mass Spectrometry 基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱， 是一种新型的软电离生物质谱,LC-ESI-MS/MS: 高效液相色谱-电喷雾串联质谱,MALDI-TOF-TOF：基质辅助激光解吸离子化-串联飞行时间质谱,MALDI-Q-TOF：基质辅助激光解吸离子化-三级四级杆-飞行时间质谱,基本缩略词,10,PMF： Peptide Mass Fingerprinting (肽质量指纹谱)， 是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的 肽片段的质量图谱,蛋白质组学研究中，质谱测序一般采用两种方式： 一种是利用串联质谱 (MS/MS) 测序； 另一种是利用源后衰变 (PSD：post-source decay) 技术测序,基本缩略词,IPG(EF)：Immoblized pH gradients isoelectric focusing (固相pH梯度等电聚焦),11,PMF常用软件,Mascot: ,Profound: P,PepIdent: www.expasy.ch/tools,ProteinProspector: P,PepSea: 8,12,常用串联质谱检索工具,SEQUEST: F/sequest,PepFrag: P,ProteinProspector: P,Mascot: ,13,基于2DE的差异蛋白质组分析技术流程,14,Provides a hard-copy record of separationAllows facile quantitationSeparation of up to 3000 different proteinsHighly reproducibleGives info on Mw, pI and post-trans modificationsInexpensive,Limited pI range (4-8)Proteins 150 kD not seen in 2D gelsDifficult to see membrane proteins (30% of all proteins)Only detects high abundance proteins (top 30% typically)Time consuming30% of spots with multiple proteins from pI 4-7,2DE:Advantages & Disadvantages,15,传统的基于2DE的差异蛋白质组学分析技术,优点：,技术路线成熟,重现性和直观性好,费用较低,展示差异蛋白质的PI和Mw,缺点：,蛋白质共迁移(comigration)问题，不适合于很复杂的样品,线性动态范围较窄,强疏水性，强硷性，分子量过大(150kD）的 蛋白质受到限制,16,基于Shotgun差异蛋白质组分析技术流程,iTRAQ-LC-MS/MS,17,18,Alleviate some limitations of the 2-DE/MS methodGenerally high throughputProtein identification and quantification is straightforwardprocess is simpleCan be used to ID post-trans. modifications,Requires more handling for sample isotopic labeling Low reproducibilityRequires high level expertiseShowed biases for high Mr proteins and against certain types and classes of proteins,Advantages Disadvantages,Shotgun:Advantages & Disadvantages,19,Sensitivity and dynamic range of protein analysis methods,20,IPG(EF):Immoblized pH gradients isoelectric focusing(固相pH梯度等电聚焦),建立于20世纪80年代，一种新型等电聚焦技术。利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定，在滴定终点形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合。,优点：与传统两性电解质等电聚焦相比，具有分辨率更高、上样量更大。 分辨率可达0.001pH, 是目前分辨率最高的电泳方法,可用于等电点及其附近的蛋白质和多肽的分析、制备,特点：形成固定的、不随环境电场等条件变化的pH梯度,21,使用宽pH范围的胶条（pH 3-10）可以在同一块凝胶上看到样品中绝大多数的蛋白质。将有重叠区域的窄pH梯度的胶条联合使用，也同样可以得到整个pH 3-10范围的结果。因为绝大多数蛋白聚焦在pH 3-10的中间区域，所以研究人员有时选用非线性梯度的胶条，这种胶条将两端的pH梯度压得很窄，却可以使中间区域的蛋白质得到较好的分离。将窄pH梯度的线性IPG胶条重叠使用，效果要比用非线性胶条好得多，它可以检测出样品中更多的蛋白质斑点。,pH 梯度范围的选择,22,常用蛋白酶抑制剂,23,优点: 样品和对照之间的差异蛋白质展现在同一胶上,能直观可靠确定; 对isoform 的定量较准确; 比传统2DE动态范围有所增加.缺点: 标记效率低只Lys的氨基的1%左右; 受限于2DE的分离能力; 受蛋白质在2DE上共迁移现象的影响,可能对复杂样品的isoform定量产生影响.,2-D Difference Gel Electrophoresis (DIGE),24,Cys-labelingModify before digestHigh probability of losing PTM,缺点: 只标记Cys，没有Cys的蛋白质得不到鉴定。纯化含Cys肽段时，有效肽段损 失巨大(达90%)。ICAT 分子量大，对于较小肽段影响数据库的搜索。2H, 1H 标记的肽段在反相分离时表现出轻微的洗脱时间不 一致现象，使得定量困难.,ICAT Workflow (技术流程) 补充,优点: 克服了2DE方法相应的缺点。 只鉴定含cys的肽段,减少了质谱分析的复杂程度。,25,Isobaric labeling: N-term + LysModify after digestRequires MS/MS measurements,优点: 全标记，范围广，灵敏度高于ICAT。 可以做绝对定量。,缺点: 需要MS/MS分折后才能定量; 酶解后标记样品复杂程 度高; 只适合LC-MALDI-TOF/TOF或LC-MS/MS。,iTRAQ Workflow (技术流程) 补充,26,The mass difference between labelled (12C/13C) and unlabelled peptides are 105.0215Da/111.0419 Da for each modified amino group: Lys + Protein N-term.Dm = 6.0204 Da/mod Lys residue,优点： 蛋白水平标记，全标记NH2，范围广，灵敏度高，有利于兼容其它蛋白 质的分离分法如2DE，SDS-PAGE等。所有的质谱都可以分析，包括离子阱。缺点：需要用除Trypsin 以外的酶切，以提高蛋白质的鉴定率和定量率。,ICPL Workflow (技术流程) 补充,ICPL Reagent Structure,27,Acid Cleavable ICAT Reagents (ABI) 补充,优点：移去了亲和基因使标记的肽段分子量整体减小，提高了质谱分析中的效率和 降低了数据库搜索的复杂性。标记在C上使得共流出时间一致。缺点：同ICAT试剂差不多。,28,SILAC Workflow (技术流程) 补充(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture),优点： 省去了体外标记化学反应和分离纯化步骤， 有利于低丰度蛋白质的检测定量。 完全兼容任何传统的蛋白分离手段。,缺点： 不能对组织样品进行分析定量。 培养细胞在富含稳定同位素介质中生长， 可能会影响细胞的繁殖，由此改变蛋白质的 表达水平。 昂贵。不适用于人体样品。,29,Enzymatic labeling: trypsin catalyzed O16 to O18 exchange 补充,优点： 方便对MS/MS扫描时Y系列离子的识别。 简单，快速。 完全标记，不带倾向性。 不会丢失翻译后修饰信息。,缺点： 不稳定。 完全标记后肽段只相差4Da。,30,Label-free strategies:Extracted ion current (XIC)-based quantification 补充,优点： 可准确定量。 不需标记，可对任何样品进行定量。 不丢失任何修饰信息。,缺点： 在样品定量分析时，容易出错。 需做平行的两次实验，对仪器，环境等要求高。 不适合时，两个独立的样品进行多次纯化。,31,Peptide ions from more abundant proteins would be selected more frequently in MS spectrum.,LC-MS/MS,Spectral counts OR number of peptides identified for each protein,根据spectral counts 的数目直接估计丰度或根据公式计算出一个丰度值,例子: emPAI =10PAI-1,where PAI is the number of observed peptides divided by the number of theoretically observable peptides. M.Mann et al MCP 4.9 1265-1272,Semiquantification: Spectral counts 补充,优点: 简单，直接，多用于单个复杂样本内蛋白质之间的相对定量.,缺点: 尚无报道用于两个样本之间蛋白质的定量；不同样本、不同LC-MS/MS之间的比较不太准确.,二、血浆/血清蛋白组学,32,(Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP),33,HUPO PPP,2001.10. 国际人类蛋白质组组织(Human Proteome Organization, HUPO)，在美国成立。启动人类蛋白质组计划(HumanProteome Project, HPP).,HPP的主要研究目的：鉴定人类基因组编码的全部蛋白质及其功能；揭示： 构成各种人类组织不同细胞类型的蛋白质表达谱； 蛋白质组翻译后修饰谱； 蛋白质组亚细胞定位图； 蛋白质-蛋白质相互作用关系图； 蛋白质结构与功能联系图,34,HPP首批执行计划：人血浆蛋白质组计划 (Human Plasma Proteome Project，HUPO PPP)人肝脏蛋白质组计划 (Human Liver Proteome Project，HLPP ),HUPO PPP由美国科学家Gilbert Omenn牵头十多个国家/地区、57个实验室参与,HUPO PPP,35,HUPOPPP的先期(pilot phase)目标： 比较不同样本收集、处理和储存过程对蛋白质分析的影响； 通过分析血浆蛋白质组，比较不同蛋白质组分析技术平台的 敏感性和局限性； 比较不同高丰度蛋白去除(depletion)方法，以及去除与否 对蛋白鉴定的影响； 数据提取、整理和储存的标准化,目的： 全面认识人类正常血浆/血清中的全部表达蛋白 全部表达蛋白在不同生理条件下的变异度,HUPO PPP,36,人血浆/血清蛋白质组学研究的特别意义,Gilbert Omenn，2006.12人血浆蛋白质学的专著,37,人血浆/血清蛋白质组学研究的独特地位,人血液中蛋白质的来源几乎与所有细胞、组织、器官有关 人血液中蛋白质可以直接反映机体的病理、生理状态。即机体中的 每一个细胞都可能将反映其生理状态的记录，以排泄物或信号分子的 形式释放到血液中 人血液中蛋白质是发现各种疾病相关的已知和/或未知生物标志物的 最有价值的标本,常规的血液检查仅仅能反映血液所携带信息中的很少的部分；在疾病的早期诊断方面，迫切需要发现更有效的疾病标志物， 但迄今为止，公认的新的疾病标志物的数量极少。,38,人血浆蛋白质总况,血浆大约含有7%的蛋白质，1%的其它物质，92%的水分。 这些蛋白质包括维持机体正常生理状态的蛋白质，各种病理、 生理状态下机体细胞和组织分泌、脱落的蛋白质,血浆蛋白质总数估计在10,000种甚至更多,所含蛋白总量达到60-80mg/ml。血浆中总蛋白量的99% 由为数不多的22种高丰度蛋白所占有,血浆中蛋白质浓度在一个高动态范围内(912个数量级)变动 从3550 mg/ml的血清白蛋白，到110 pg/ml或更低的趋化因子,39,人血浆蛋白质组的组成,a. 组成性蛋白 主要指肝脏和小肠的分泌蛋白，它们在血浆中发挥作用， 如白蛋白，纤维蛋白原等b. 免疫球蛋白 血浆中大约含有数百万种抗体,血浆蛋白根据其来源和功能可分为：高丰度蛋白和低丰度蛋白,高丰度蛋白：,40,低高丰度蛋白,c. 组织渗漏蛋白：组织新陈代谢或发生病理改变导致细胞损伤、 死亡而进入血液的蛋白质，可用于疾病的诊断及愈后评价 如心肌钙蛋白(cardiac troponins)，或心肌球蛋白(myoglobin) 用于诊断心肌梗塞,d. “远距离”受体和配体：肽类及蛋白质类激素，如胰岛素等 生长因子；临时信使，如非激素类的蛋白,e. “局部”作用的受体和配体：细胞因子及细胞反应调节因子， 如IL-8,f. 一过性通过蛋白：如脂蛋白、溶酶体蛋白酶,g. 异常分泌蛋白：如前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤 相关蛋白,41,意义：认识疾病演变过程，分离疾病特征标志和药物靶标如：细胞死亡或损伤后被释放到血浆中的组织渗漏蛋白， 肿瘤或其他病变器官释放到血浆中的异常分泌蛋白等,特点：种类繁多，性质各异，作用重要，分离和鉴定相当困难,h. 外来蛋白：如异常微生物、寄生虫、病毒的病原蛋白 及其释放的蛋白,i. 小分子量的蛋白及多肽组份：主要是细胞因子、 多肽类激素及较大蛋白的酶解片断,42,A. 人血浆中十种丰度最高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约90%。,B. 人血浆中十二种丰度较高的蛋白质，它们占有总蛋白质量的大约9%。,占总量的1%，其数量多、含量低，但最受关注。,54.31%,16.61%,3.32%,3.64%,3.83%,1.98%,3.45%,2.94%,1.12%,43,血浆蛋白组成复杂，蛋白丰度水平差异巨大,44,45,从相对分子质量的分布看，10100 kDa的蛋白质占有相当大的比例，其中： 18% 20 k Da 69% 60 k Da,289种血浆蛋白的分子量大小分布,46,人血浆蛋白是血浆中的所有蛋白质统称，来源广、 组成复杂、种类与数量多,人血浆/血清蛋白质组学研究的特殊性,人血浆蛋白质性质的动态范围广，对定量检测要求高,人血浆蛋白中的高丰度蛋白对与疾病关系更密切的 低丰度蛋白研究的干扰大,人血浆蛋白质受取材方式的影响较大,血浆蛋白的不稳定性,数据间的可比性差,47,血浆/血清蛋白质组研究中需要着重注意的问题,1、样品的选择,2、样品的收集与贮存,3、去除高丰度蛋白和分级技术,4、多维策略的运用,48,蛋白质组学研究中，选用血清或血浆的结果差异很大,样品的选择,血浆和血清的形成方式不同，所含蛋白的种类与数量不同血清：纤维蛋白被凝结去除，与纤维蛋白结合的蛋白被损失； 凝结过程中血细胞元素释放大量肽段血浆：抗凝剂 (EDTA、枸橼酸、肝素) 的选择影响研究结果， 尤其是对细胞因子的影响大,分析低分子量的蛋白质时： 适于选用去除血小板的EDTA血浆或枸橼酸血浆样品,肽组学研究时： 最好选用去除血小板的血浆,49,样品的收集与贮存,收集管： 商品化收集管含有多种成分可能干扰或混淆质谱测定； 可能含有一些促凝或抗凝物质； 可能会吸附一些低丰度蛋白，干扰血浆/血清中低丰度蛋白的鉴定,抗凝剂种类，血清凝集时间，血浆孵育时间和温度,贮存： 室温4小时或6小时，血样品变化很小 8小时后、特别是24小时后质谱分析结果有明显变化 4下的结果与室温下结果差不多，时间推移到48小时或96小时， 变化非常显著；长期存放在-20，-80，或液氮中没有太大的变化反复冻融次数增加却有很大影响,50,样品的贮存与结果,Marshall et al., 2006,51,1)血浆或血清参考样本收集处理必须在2h小时内完成；2)血浆采用用加入1.0ml枸橼酸钠(0.105mol/L)抗凝剂(与血的比例为1:9)或者采用喷雾干燥的EDTA为抗凝剂；血清在室温下30min内用微粉硅胶促凝后分离。分别收集10ml。3) 分离在2-6下操作(枸橼酸血浆，血小板计数要小于130/ul) 。离心后混合即分装到250ul硅烷化EP管中，-70保存。,4) 无HIV、HBV、HCV、HTLV-1 (人类T细胞亲淋巴病毒1型)、 梅毒，无任何肝损伤。5)整个过程不加cocktail等蛋白酶抑制剂。6)所有供血者应清晨空腹取血；24h内无服药和酒。此后的血浆蛋白质组学研究大多 采用了这一套程序。,Tirumalai R.S., Chan K.C., Prieto D.A.,et al. Mol Cell Proteomics.2003,2: 1096-1103,HUPO PPP在先期研究中采用的统一样本标准,52,4下处理血液标本，2h内尽快分离血清及细胞；用U9缓冲液 (9mol Urea, 2%CHAPS, 1%DTT) 稀释血清后，可以24h内在室温下运送或对血清及WCX（弱阳离子交换）磁珠结合过程进行操作；血清应分装并长期储存在-80或液氮，但限冻融1次；溶血标本应弃用，建议重新取血。,刘建栋 等。基础医学与临床, 2007, 27(2)193-197,CHAPS: 3-(3-胆酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸, 两性离子表面活性剂DTT: 二硫苏糖醇(dithiothreitol), 还原剂,用于蛋白质质谱分析的血液标本的处理、运送、操作及储存的标准建议条件,53,高丰度蛋白的去除和分级技术,54,高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测,A: AlbuminB: TransferrinC: Apo A-I lipoproteinD: Haptoglobin b-chainE: a1-Antitrypsin,PPI Website Oct 2002，Plasma Proteome Institute,55,未去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果,去除高丰度蛋白的肝癌患者血浆的2-DE分离结果,高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测-肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后2-D分离结果,56,高丰度蛋白的去除策略,亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离,抗体的亲和法,染料的亲和法,抗体亲和法利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白,染料亲和法通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。,57,正常人血浆,MARS亲合柱（结合组分-BF、流出组分-FF）,结合组分、流出组分蛋白的胰蛋白酶切,肽段的阳离子交换色谱分离,反相色谱分离离子阱质谱鉴定,Sequest软件数据检索,SepproTM MIXED12亲合柱（结合组分-BF、流出组分-FF ）,数据整合与分析,去除血浆高丰度蛋白的技术路线,58,HPPP,Attempts for the depletion of high abundant proteins,59,多重亲和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆2DGE图谱,安捷伦高丰度蛋白去除柱 (MARC),60,商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统,ProteomeLab IgY蛋白质组分组分离系统(Beckman Coulter 公司),ProteoExtract Albumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒 (MERCK公司),AurumSerum高丰度蛋白去除试剂盒(Bio-Rad公司),Agilent Multiple Affinity Removal Column (MARC)安捷伦高丰度蛋白去除柱 (安捷伦公司),ProteoPrep 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20)去除血浆中20种高丰度蛋白 (Sigma-Aldrich公司),61,血清/血浆高丰度蛋白清除柱,A,B,问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？,各抗体以特定比率混合装填成色谱柱,62,血浆蛋白组成复杂，蛋白质组学研究技术各有利弊，单一技术平台不能达到最佳分离效果。,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段主要包括：去除高丰度蛋白样本预分离系统分离系统质谱鉴定系统,63,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,获得了325个完整的蛋白质,高丰度蛋白去除+色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定,两名健康男性血清,免疫亲和吸附法去除血清8种主要的高丰度蛋白,色谱预分离(pre-fractionation)， 离子交换色谱(anion-exchange chromatography，AEC) 分子筛色谱(size-exclusion chromatography，SEC),2-DE分离富集的低丰度蛋白组分(fractions),近3700个蛋白质点,MALDI-TOF质谱鉴定,LC-MS/MS串联质谱进一步分析未能鉴定的蛋白质点,Pieper R. et al. 2003, Proteomics, 3(4):422-432,64,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,鸟枪测序法(Shotgun sequencing)，即高丰度蛋白去除 + 全蛋白酶解 + 二维液相色谱(阳离子/阴离子交换色谱 + 反相色谱)分离 + 质谱鉴定(离子阱或Q-TOF串联质谱),Adkins JN. et al. 2002, Mol Cell Proteomics, 1(12):947-955,女性志愿者血清,protein A/G吸附去除免疫球蛋白,胰蛋白酶对血浆全蛋白酶解,强阳离子交换(strong cation exchange, SCX)反相(reversed phase)色谱分离,电喷雾液相离子阱质谱(LCQ Ion Trap)鉴定,490种不同血浆蛋白,蛋白质鉴定效率提高了3-5倍,操作繁杂，自动化程度比较低影响因素较多稳定性有待提高,65,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,血浆全蛋白预分离(色谱聚集+反相高压液相色谱) + 组分胰蛋白酶酶解 + 串联质谱鉴定 (LC-ESI-MS-MS或2D-micro-LC+MALDI-TOF-TOF-MS ),Beckman Coulter公司于2003年下旬推出ProteomeLab PF 2D system完整血浆蛋白预分离系统,血浆蛋白先经多维色谱分离,分离组分经胰蛋白酶酶解,质谱鉴定,克服了2-DE的缺点，操作简单，自动化程度高，简化了信息处理提高了低丰度蛋白质、膜蛋白、分子量特别大和特别小的蛋白质的分离检测能力回收率高，能保持蛋白质的完整性和活力。,66,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,多重窄pH范围2-DE+联合质谱鉴定(MALDI-TOF+LC-MS/MS),Starita Geribaldi M et al. 2003, Proteomics, 3(8):1611-19,使用相差1个pH范围的多重固相pH梯度干胶条，大大提高了传统2-DE的分离效率,MALDI-TOF + LC-MS/MS联合质谱分析,蛋白质鉴定的效率增长两倍，极酸和极碱性蛋白质的分离和鉴定效果,67,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,非变性等电聚焦预分离 + 变性等电聚焦预分离 + 1D分离 + 质谱鉴定(LC/MS/MS ),Giometti在非变性条件下(不破坏蛋白质的三级结构)进行二维电泳分离,分离到的蛋白质仍然保持原始状态,使蛋白质生物功能和蛋白质之间相互作用的检测成为可能,克服了传统2-DE (采用变性条件)的缺陷,Manabe等通过采用非变性二维电泳与变性二维电泳相结合的方法,血浆中分离，鉴定出多个IgG结合蛋白,68,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,SELDI-TOF分离 + Q-TOF质谱鉴定,表面增强激光解吸/离子化 -飞行时间质谱(surfaceenhanced laser desorption/ionization-time of flight,SELDI-TOF)是一种以固相表面亲和为基础的质谱分离技术,完整血浆蛋白先经过与不同亲和表面(化学表面芯片和生物表面芯片)结合纯化,SELDI质谱分离,Q-TOF质谱鉴定,差异蛋白质，尤其是小分子蛋白,血浆蛋白的分离和鉴定中与上述其他技术具有很大的互补性,用于疾病相关的血浆蛋白质组研究,69,血清/血浆蛋白组学研究的多维策略,进行OGE之前用免疫方法去除6个血浆中的主要蛋白质，用1.5 mg分离组分，顺利获得81种蛋白质，其中仍有1个免疫球蛋白,脱离凝胶电泳(Off-gel electrophoresis，OGE)技术,Heller M. et al, 2005, Electrophoresis, 26(6):1174-88,应用OGE技术经2个步骤将完整的蛋白质和肽段分解成散在的液态片段,LC-MS/MS分析肽片段,用1.5 mg人血浆蛋白获得了53个蛋白质，其中10个为不同的免疫球蛋白,12 mg人血浆蛋白，获得73个蛋白，其中15个与免疫球蛋白相关,处于试验阶段,70,血清/血浆蛋白组学研究中多维策略的优势,2D,1D,3D,4D,Plasm/Serum,Plasm/Serum,Plasm/Serum,Plasm/Serum,1 LC-MS/MSrun,20-40 LC-MS/MS runs,100-150 LC-MS/MS runs,100-150 LC-MS/MS runs,1D SDSPAGE,MicroSol-IEF,1D SDSPAGE,1D SDSPAGE,MicroSol-IEF,Major ProteinDepletion,100,800-1000,2000+,2800+,UniqueProteins,MicroSol-IEF：microscale solution IEF 微量等电聚焦电泳,71,血清/血浆蛋白组学研究的临床应用,生物标志物的识别,淀粉样变和沉积疾病,遗传性疾病,免疫蛋白质组学,脂质组学,降解组学和多肽组学,72,血清/血浆蛋白组学研究的临床应用,淀粉样变和沉积疾病,遗传性疾病,免疫蛋白质组学,脂质组学,淀粉样变病(amyloidosis)是指一些以折叠结构的纤维蛋白(鉴定成分)为主的淀粉样物质在器官组织细胞外沉积所引起的疾病,如先天性糖代谢缺乏综合征,识别组织相容复合物(MHC)、特异抗体的抗原、外源病毒或疾病产生的蛋白,识别脂蛋白及结合蛋白,73,血清/血浆蛋白组学研究的临床应用,降解组学和多肽组学,识别与鉴定与疾病、生物过程中蛋白代谢特异相关的多肽,生物标志物 (Biomarkers),生物标志物现特指疾病或机体状态的信息指标，如基因序列或突变、mRNA 表达谱或组织蛋白等。主要指正常生物学过程、致病过程或干预疗法的药理反应等过程的一种生物指标,FDA在“药物基因组学“提出”有效生物标志物“有效生物标志物”是一种得到广泛认可的，具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标”,74,血清/血浆蛋白组学研究的临床应用,理想的生物标志物具有的特点,与疾病发生、发展机制紧密相关：具有较好的诊断、危险性分类 和预后评估的价值,真实性 具有良好的灵敏度和特异性具有可预测性 常用预测值 (predictive value，PV) 表示，包括阳性预测值(PPV) 和阴性预测值 (NPV)能有效地用于临床疾病的分型,检测方法可实现标准化 易于掌握和推广应用，具有非创伤性，适合于高通量分析，费用适当,75,Petricoin等用疏水型芯片结合并分离了卵巢癌患者血浆相关蛋白，在肿瘤和健康血清之间发现了5个差异明显的蛋白质峰，它们共同构成卵巢癌诊断模型,用该模型对肿瘤和健康人血浆进行盲筛，该模型诊断肿瘤的敏感性为100%，特异性为95%,血清/血浆蛋白组学研究的实例,76,Li等选用金属离子鳌合芯片结合并分离乳腺癌血浆蛋白，发现3个乳腺癌特异的差异蛋白峰。用这3个特异蛋白标志盲筛一组乳腺癌和健康人血浆蛋白，乳腺癌检出的敏感性为93%，特异性为91%,血清/血浆蛋白组学研究的实例,77,三、尿蛋白质组学,Urinary Proteomics,78,尿蛋白质组学研究的独特地位,标本获得上：方便、无害、量大,保存上：相对稳定,尿液中的蛋白质组成,可溶性蛋白固相成分,正常人的尿液中存在1500种以上的蛋白质,来源于大蛋白质分子裂解的大量多肽片段,79,尿蛋白质的来源：可溶性蛋白,80,尿蛋白质的来源：固相成分,注1：上皮细胞包括尿足细胞（urinary podocytes）、尿道上皮细胞在内的各种泌尿器管道的 上皮细胞,81,尿蛋白质组学的研究意义,in the early diagnosis of disease in classification of disease with regard to likely therapeutic responses in assessment of prognosis in monitoring response to therapy,These approaches have potential value, not only in diseases of the kidney and urinary tract, but also in systemic diseases that are associated with circulating small-protein and peptide markers that can pass the glomerular (血管小球的) filter.,82,一个经典流程,尿蛋白质组学的研究范例,1D：one-dimensional; HPLC：high-performance liquid chromatography HAS： human serum albumin MW：molecular weight LC：liquid chromatography MS：mass spectrometry SDS：sodium dodecyl sulfate,83,以1D SDS 和 RP HPLC对尿蛋白质组进行分离和分级,对分离和分级后的蛋白质组成份进行胶上或溶液内酶解，以LTQ-FT 和 LTQ-Orbitrap两种质谱仪进行MS、MS-MS分析,从十名健康受试者的尿中鉴定出了1543种蛋白,尿蛋白质组学的研究范例,Gene Ontology (GO)分析表明, 几乎有一半是膜蛋白,细胞外蛋白、溶酶体和细胞质膜蛋白均在尿中得到富集,尿中的细胞质膜蛋白可能来自exosomes的分泌,Gene Ontology（GO）包含了基因参与的生物过程，所处的细胞位置，发挥的分子功能三方面功能信息，并将概念粗细不同的功能概念组织成DAG（有向无环图）的结构。GO表示各物种的基因功能分类体系，较全面地概括了基因的功能信息。在基因表达谱分析中，GO常用于提供基因功能分类标签和基因功能研究的背景知识。利用GO的知识体系和结构特点，可发掘与基因差异表达现象关联的单个特征基因功能类或多个特征功能类的组合。,84,acetone precipitation（丙酮沉淀）,Ultracentrifugation（超速离心）,The urine samples were fractionated by two different methods. The proteins were separated by 2D-PAGE.,尿蛋白的分离,85,2-DE comparing the urine of septic（败血症） rats without ARF to septic rats with ARF,Urine was pooled from three animals for each group. Red indicates increased protein abundance with ARF(Acute Renal Failure, 急性肾功能衰竭) Green indicates decreased protein abundance with ARF Yellow indicates no change in abundance The spot labeled A is ventral prostate-specific protein which did not change in abundance,86,激素敏感型与激素耐药型先天性肾病综合征的SELDI-TOF-MS研究,尿蛋白组学研究举例,激素敏感型（Steroid-Sensitive，SS）INS与激素耐药型（steroid-resistant，SR）INS的临床鉴别难度大，临床的极早期诊断意义重大Robert P. Woroniecki等建立了一种基于SELDI-TOF-MS的研究策略，分别以CM10， IMAC 30，H50和Q10蛋白质芯片对激素敏感型NS、激素耐药型NS进行分析,87,使用不同的蛋白质芯片分析激素敏感型INS或激素耐药型INS患者尿样，在不同的相对分子质量区域出现了差异蛋白条带经BPS综合分析，最终确认质量数4,144 Da的条带在从激素敏感型NS患者中鉴别激素耐药型NS患者具有特别重要的意义。,88,四、唾液蛋白质组学,Salivary Proteomics,89,概念,以“组学”的研究思路寻找、发现和鉴定唾液中与疾病发生、发展、治疗过程相关的生物标志物（蛋白质、多肽），阐明疾病的发病机理，建立新的临床诊断指标,90,唾液（Saliva）主要是腮腺、舌下腺、下颌下腺的分泌产物 唾液与血液、尿液一样，在疾病的临床筛查、诊断中具有重要意义的诊断样品。人体的多种疾病、影响唾液成份，唾液蛋白成分可提供局部或全身性病症的线索和状况。,唾液(Saliva)及对疾病的诊断意义,下颌下腺(submandibular, SM),舌下腺 (sublingual, SL),腮腺(parotid),三叉神经,面神经,91,水分(99%)酶酶阻滞物生长因子细胞因子免疫球蛋白粘液素糖蛋白少量无机盐等,唾液的成分,92,a：血清成分的选择性主动转运b：脂溶性成分的被动扩散c：选择性成分的简单过滤d：腺泡细胞活化泵将水合Na+转运至 唾液腺导管e：唾液腺导管细胞将低渗唾液中的 Na+泵回血液。图中，f为细胞膜，g为细胞膜孔，h为细胞间隙，i为腺泡细胞。唾液成分与血清成分是有密切的关系,唾液分泌与血清关系,93,唾液中的主要功能蛋白质,SalivaryFamilies,Anti-Bacterial,Buffering,Digestion,Mineral-ization,Lubrication & Viscoelasticity,TissueCoating,Anti-Fungal,Anti-Viral,Carbonic anhydrases(脱水酶),Histatins(富组蛋白),Amylases(淀粉酶),Mucins(粘蛋白), Lipase(脂酶),Cystatins(胱蛋白),Histatins,Proline-rich proteins,Statherins,Mucins, Statherins,Amylases,Cystatins, Mucins, Proline-rich proteins, Statherins,Histatins,Cystatins,Mucins,Amylases, Cystatins,Histatins, Mucins,Peroxidases,蛋白类,94,唾液蛋白质组学的主要研究内容,发现新的唾液生物标志物（salivary biomarkers）与药物作用靶点唾液蛋白质组学的分析技术齿龈沟液（gingival crevicular fluid）的蛋白质组学分析肿瘤诊断中的唾液蛋白质组学舍格伦综合征（Sjogrens Syndrome）的蛋白质组学 （舍格伦综合征为一种自身免疫性疾病，特征: 外分泌腺的进行性破坏; 粘膜及结膜干燥，伴有各种自身免疫性病征。90%发生于中年妇女。主要临床表现为口腔、眼和其他部位粘膜干燥，常合并发生类风湿性关节炎）糖尿病患者的唾液分析唾液转录组学（saliva transcriptomics）,9