苛养菌的分离培养

苛养菌的分离培养及鉴定方法,何为苛养菌？,1.苛养菌主要是指对生长环境、营养要求较苛刻的细菌，在普通环境中不能或难以生长。 体外培养需添加特殊因子或其他营养成分。 2.苛养菌在临床上涉及到的主要有：嗜血杆菌属、肺炎链球菌、化脓性链球菌、奈瑟氏菌、布拉汉氏菌、军团菌等 3. 有一些特殊的实验可帮助苛养菌的鉴定，一些选择性培养基可帮助细菌的鉴定。,血平板培养基,血平板培养基又叫血平板，主要用于链球菌及其他苛养菌的分离、培养及溶血活性的检测。主要成分：其中的蛋白胨和牛肉粉主要提供细菌生长所需要的碳源、氮源、氨基酸及维生素。氯化钠维持培养基中的渗透压，琼脂用做凝固剂。脱纤维羊血一方面提供一些特殊的生长因子，另一方面用于观察溶血反应。,A嗜血杆菌属,与人类密切相关的嗜血杆菌有8种，比较常见的是流感嗜血杆菌和副流感嗜血杆菌。流感嗜血杆菌简称流感杆菌，属嗜血杆菌属。本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长，故名嗜血杆菌。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属中最常见的对人有治病性的细菌，可引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染。近年来也是社区获得性肺炎的主要病原菌。,流感杆菌(Hemophilus influenzae)是人类上呼吸道的正常菌群，以往一直被误认为是流行性感冒的病原菌，但实际致病范围极广，除引起呼吸道病变外，尚可引起脑膜炎、败血症、结膜炎、女性生殖道感染、蜂窝织炎等。不仅是婴幼儿感染的常见致病菌，亦是成人感染的病原菌之一。,1.形态与染色 流感嗜血杆菌是一群无动力、无芽孢、呈球杆状或多形态的革兰阴性小杆菌。菌落为圆形、无色、透明。2.培养特性需氧或兼性厌氧，培养时需要X因子和V因子。血液中因x子经加热可释放，故常用巧克力色培养基分离培养。另外金黄色葡萄球菌生长时能产生本菌需要的V因子，,因此与金黄色葡萄球菌共同培养时，离金黄色葡萄球菌菌落近的生长好，形成卫星现象。副流感只需V因子，杜克氏只需X因子。 该菌的药敏实验为HTM平板,3.致病物质和所致疾病 致病物质主要为荚膜、菌毛与内毒素。根据荚膜多糖，b型致病力最强。所致疾病分原发感染和继发感染两类，前者为急性化脓性感染，后者常在流感、麻疹等感染后发生，临床有慢性支气管炎、中耳炎、鼻窦炎等，多见于成人。,于1930年，流感嗜血杆菌分类为两类，即荚膜菌株及没有荚膜的菌株。虽然已知荚膜类的乙型流感嗜血杆菌是毒性的主因之一，但感染流感嗜血杆菌的病因仍未完全清楚。它们的荚膜能帮助它们抵抗在没有免疫的寄主体内的吞噬作用及不触发补体介导的裂解。没有荚膜的菌株则较少侵略，但它们能诱发炎症而产生其他病症，如会咽炎。,病源菌根据不同的生化反应可分为6个生物型：、和。致病者多为、和型。根据荚膜多糖抗原性不同，可将有荚膜菌分为a、b、c、d、e和f6个血清型。b型致病力最强，其次为e和f。根据细菌外膜蛋白（OMP）又可分为不同的亚型。有荚膜者致病力大于无荚膜者。,流感杆菌主要通过呼吸道在人与人之间传播，也可通过孕妇产道感染。新生儿由于有来自母体的被动免疫，故2个月内发病率低，3个月至3岁儿童的血清抗体水平最低，此期易产生感染,杜克雷嗜血杆菌,杜克雷氏嗜血杆菌的形态特点是短而细小，呈短棒状，两端较为钝圆。长约1.5微米，宽约0.5微米。往往成双平行排列呈双链状。大多数细菌分布在细胞外呈链状排列，仅少数细菌可在细胞内呈团块分布。人是它的储存宿主。对温度的敏感性很高，不耐热，超过38时就很快死亡。干燥及65时均可迅速死亡。但它的耐寒性能较强。,从病灶中或培养菌落中取材检查可见2个或2个以上细菌连成锁状有如鱼群在游泳。故称鱼群状。在淋巴腺组织切片中可见典型的连锁杆菌。,杜克雷嗜血杆菌对温度较敏感，43-44以上温度则失去抵抗能力，20分钟即可死亡。对42抵抗性稍强，但4小时死亡。在37中可活6-8天，10-20之间7-10天后可死亡，在此温度中较大肠菌、葡萄球菌抵抗力弱，较淋球菌强，对寒冷抵抗力较强，5中可生存1周，冻干时可能生存1年。对干燥的抵抗性弱。在人工培养中温度是发育的重要因素。,在19世纪以前人们把梅毒与软性下疳混为一谈。直到1889年，意大利皮肤病学家杜克雷从3例患有生殖器溃疡的病人患部取脓性分泌物，接种到自己身上，并形成了溃疡。他在自身患部排出的脓性分泌物中发现一种微生物，这种微生物特别喜欢在含有新鲜的人血或兔血的培养基上生长，所以被称之为杜克雷氏嗜血杆菌。就是以后证实的软性下疳致病菌。,杜克雷嗜血杆菌对X因子需要性高，不需要V因子，将纯培养物注射入家兔可引起面部溃疡性病灶，人感染后，不能产生持久免疫力。,B肺炎链球菌,1.形态与染色该菌为革兰染色阳性，菌体呈矛头状、成双或短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。普通染色时荚膜不着色，表现为菌体周围透明环。无鞭毛，不形成芽孢，菌体衰老时可呈现革兰染色阴性。,2.培养特性和生化反应营养要求及在血平板上菌落特征基本同甲型链球菌，培养时间稍久菌落中央下陷呈脐窝状，在血清肉汤中培养稍久亦因细菌自溶而使浑浊的培养液变澄清，自溶酶可被胆汁或胆盐等物质活化，加速细菌溶解，故可用胆汁溶菌试验与甲型链球菌相区别。 该菌通过optochin敏感实验得到鉴定。,该菌的药敏实验平板为血MH平板，放CO2环境*1ug苯唑西林纸片可用来筛选P耐药，但须认识到，当OX20mm时表明肺炎链球菌对P敏感，此菌往往也对其他B-内酰胺（包括阿莫西林和多数头孢素）抗生素敏感；如果OX=1：160-320为阳性。对慢性患者可进行补体结合试验测IGG，一般以1:10为阳性诊断标准，可诊断慢性或曾患过布鲁菌病。,培养与鉴定在血琼脂平板培养5-7天可形成灰色不溶血菌落。在固体培养基上菌落为无色、半透明、圆形、表面光滑、边缘整齐、中央稍凸起，直径为2-3mm;有时可出现粘液或干燥的硬皮样菌落。液体培养基呈轻度浑浊有沉淀，不形成菌膜。培养=30天才能报告阴性。,药物敏感试验临床治疗首选强力霉素，其次复方新诺明，由于病程长，用药时间需4-6周。药敏试验可不作为临床常规，但如需要必须采用稀释法做MIC.,-内酰胺酶以其主要水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶、超广谱酶。,根据生化特征或氨基酸序列的同源性,第一类为头孢菌素水解酶（Amp-C酶），产生菌主要系革兰阴性菌，如假单胞菌、肠杆菌、不动杆菌和克雷伯杆菌等，由染色体介导。,第二类为青霉素酶和超广谱酶，包括革兰阳性菌的青霉素酶，质粒介导的TEM和SHV酶及其衍生物组成组成的超广谱-内酰胺酶（ESBLs）、羧苄青霉素酶、邻氯青霉素酶（OXA酶）和由沙雷菌属与肠杆菌属产生的非金属碳青霉烯酶。,第三类为金属酶，由假单胞菌属、脆弱拟杆菌属、产黄菌属、沙雷菌属及嗜麦芽黄单胞杆菌属产生的可水解碳青霉烯抗生素的金属酶。第四类为其他不能被克拉维酸完全抑制的青霉素酶.,酶的特殊性、动力学参数及其基因的核苷酸序列,A 活性部位为丝氨酸残基，包括多种质粒编码的青霉素酶，如TEM1、SHV1、ROB1或PC1酶，相对分子质量29000。,B 为金属酶(metalloenzymes)，活性部位为半胱氨酸残基，产金属酶的细菌有嗜麦芽黄杆菌(stenotrophomonasmaltophila)，气单胞菌和脆性拟杆菌。该类为碳青霉烯酶，耐药的抗生素包括碳青霉烯、青霉素、第一、二、三代头孢菌素、氨曲南。,C 活性部位为丝氨酸残基，相对分子质量为39000，它的产生与-酶诱导剂有关，归因于调控基因突变，主要是染色体编码的头孢菌素酶(AmpC酶)是由染色体上一组Amp基因介导的。D 为青霉素酶，包括OXA。,超广谱内酰胺酶（ESBLs）,1什么是ESBLs？ ESBLs是英文ExtendedSpectyumLactamase缩写，中文意思是超广谱内酰胺酶，属质粒介导，它是当前抗生素出现的新的耐药趋势之一。,2产ESBLs菌株的耐药特点？ 如果临床出现产ESBLs菌株，则对第三代头孢菌素（它们是头孢噻肟、头孢他啶、头孢哌酮、头孢曲松等）耐药，及对单环酰胺类抗生素（氨曲南）耐药。ESBLs在实验室有一专门的检测方法，如果病人的药敏报告单已注明为产ESBLs菌株，则表明已经实验室确证。,如果病人药敏报告单未注明为产ESBLs菌株，三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素中有一种MIC2ug/ml，或符合CAZ22mm、ATM27mm、CTX27mm、CRO25mm其中一个，则提示菌株可能产超广谱内酰胺酶，这种情况下，即使实验室报告为敏感的第三代头孢菌素和单环酰胺类抗生素，在临床也不推荐使用。,3哪些细菌容易产生ESBLs？ 目前大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、肺炎克雷伯氏菌是最常见ESBLs菌株的细菌，其次，阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、弗劳地枸橼酸菌、铜绿假单胞菌也可出现产ESBLs菌株的细菌,4细菌为什么会产生内酰胺酶？ 由于菌株产生内酰胺酶水解青霉素G和氨苄青霉素。细菌所产生的重要抗生素灭活酶主要有内酰胺酶和氨基糖类抗生素钝化酶。内酰胺酶能裂解青霉素族和头孢菌素族抗生素的基本结构内酰胺环，从而使其丧失抗菌活性。,大部分金黄色葡萄球菌，部分流感嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、革兰氏阴性厌氧菌和少数肺炎链球菌能产生内酰胺酶从而对青霉素G和氨苄青霉素等耐药。,5促使ESBLs出现和传播的因素及临床预防 应用第三代头孢菌素治疗是导致产ESBLs菌株出现及传播的主要因素，此外，尚有其它因素。 若临床